वर्तमान *वर्तमान ठेगाना: कोलोन ५०९३१, जर्मनी, कोलोन उत्कृष्टता क्लस्टर अनुसंधान सेलुलर स्ट्रेस रेस्पोन्स इन एजिंग-रिलेटेड डिजिज (सीईसीएडी)।
माइटोकन्ड्रियाया ल्वेया न्युरोडिजेनेरेसनयात अपरिवर्तनीय मानेयाइ छाय् धाःसा न्युरोनया मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी सीमित जुइ, तर माइटोकन्ड्रियाया डिसफंक्सनया प्रभाव म्हय् न्युरोनल मेटाबोलिज्मया कोष स्वायत्तताय् बांलाक्क थुइके मफुनि। थन, झीसं माइटोकन्ड्रियाल फ्युजन डाइनामिकया बाधित कारणं जुइगु प्रगतिशील अक्सफोसया कमी दूगु पुर्किन्जे न्युरोनया कोष-विशिष्ट प्रोटिओम न्ह्यथनाच्वना। जिमिसं माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनं प्रोटिओमिक्सया ख्यलय् गम्भीर हिउपाः हःगु खने दु, गुकिलिं अन्ततः कोष सी न्ह्यः सटीक मेटाबोलिक प्रोग्रामया क्रमिक सक्रियता ब्वलंगु खने दु। अप्रत्याशित रुपं, जिमिसं टिसीए चक्र इन्टरमिडिएटया पूरकतालिसे स्वापू दूगु पाइरुभेट कार्बोक्सिलेज (पीसीएक्स) व मेमेगु पेरोक्सिडेजया स्पष्ट इन्डक्सन निर्धारण याना। पीसीएक्सया निरोधं अक्सिडेटिभ स्ट्रेस व न्युरोडिजेनेरेसनयात अप्वयेकल, गुकिलिं एथेरोस्क्लेरोसिसया अक्सफोस मदुगु न्युरोनय् सुरक्षात्मक प्रभाव दुगु संकेत बी। टर्मिनल डिजेनेरेटेड न्युरोनय् माइटोकन्ड्रियाल फ्युजनया पुनर्स्थापनां थ्व मेटाबोलिक विशेषतायात पूवंक उल्टे याइ, गुकिलिं कोष मृत्यु जुइमखु। जिमिगु निष्कर्षं माइटोकन्ड्रियाया डिसफंक्सनयात लचिलोपन प्रदान याइगु न्हापा मसिउगु लँपुया पहिचान याइ व ल्वेया लिपांगु चरणय् नं न्युरोडिजेनेरेसनयात उल्टे यायेफइगु क्यनि।
न्युरोनल ऊर्जा चयापचय कायम यायेत माइटोकन्ड्रियाया केन्द्रिय भूमिकायात मनुया माइटोकन्ड्रिया ल्वेनाप स्वापू दूगु व्यापक न्युरोलोजिकल लक्षणं बः बियातःगु दु। थ्व ल्वेय् अप्व ल्वे माइटोकन्ड्रियाल जीन एक्सप्रेसनयात नियन्त्रित याइगु जीन म्युतेसन (१, २) वा माइटोकन्ड्रियाल डाइनामिकनाप स्वापू दूगु जीन विनाशया कारणं जुइ, गुकिलिं अप्रत्यक्ष रुपं माइटोकन्ड्रियाल डीएनए (mtDNA)या स्थायित्वयात प्रभावित याइ (३, ४)। पशु मोडेलय् ज्या याःगुलिं क्यंगु दु कि वरपरया टिसुइ माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया प्रतिक्रियाय् कन्जर्भेटिभ मेटाबोलिक पथ (५-७) सक्रिय जुइफु, गुकिलिं थ्व जटिल ल्वेया रोगजननया महत्त्वपूर्ण अन्तर्दृष्टि बी। थ्व स्वया तःधंगु विपरीत, मस्तिष्क माइटोकन्ड्रियाल एडेनोसिन ट्राइफस्फेट (एटीपी) उत्पादनया सामान्य असफलताया कारणं जुइगु विशिष्ट कोष प्रकारया मेटाबोलिक हिउपाया झीगु थुइका मौलिक ख (८), ल्वेयात पनेगु वा पनेगु निंतिं छ्यलेफइगु चिकित्सीय लक्ष्यया पहिचान यायेमाःगु आवश्यकतायात बः बियाच्वंगु दु। न्यूरोडिजेनेरेशनयात पनेगु (९) जानकारीया अभाव थ्व तथ्य ख कि नसा कोषय् व्यापक रुपं वरपरया टिश्यूया कोष प्रकारया तुलनाय् तसकं सीमित मेटाबोलिक लचकता दूगु मानेयाइ (१०)। थ्व कोषतेसं सिनाप्टिक ट्रान्समिसनयात प्रोत्साहन यायेत व चोट व ल्वेया अवस्थाय् प्रतिक्रिया बीत न्युरोनय् मेटाबोलाइटया आपूर्तिया समन्वय यायेगु केन्द्रिय भूमिका म्हितीगुयात ध्यानय् तयाः मस्तिष्कया तन्तुया चुनौतीपूर्ण अवस्थाय् कोष मेटाबोलिज्मयात अनुकूलित यायेगु क्षमता लगभग ग्लियल कोषय् जक सीमित जुइ (११-१४)। नापं, मस्तिष्कया तन्तुया अन्तर्निहित सेलुलर हेटरोजेनेसिटीं विशिष्ट न्युरोनल उपसमूहय् जुइगु मेटाबोलिक हिउपाया अध्ययनय् यक्व पंगः थनी। थुकिया लिच्वः कथं न्युरोनय् माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया यथार्थ सेलुलर व मेटाबोलिक लिच्वःया बारेय् यक्व मस्यू।
माइटोकन्ड्रियाया डिसफंक्सनया मेटाबोलिक लिच्वः थुइकेत जिमिसं माइटोकन्ड्रियाया बाह्य झिल्ली फ्युजन (Mfn2)या विनाशं जुइगु न्युरोडिजेनेरेसनया थी-थी चरणय् पुर्किन्जे न्युरोन (PNs)यात अलग याना। मनुइ Mfn2 म्युतेसन चारकोट-मेरी-टुथ टाइप २ए (१५) नांया वंशानुगत मोटर सेन्सरी न्युरोप्याथीया छगू रुपनाप स्वापू दूगु जूसां मुस्याय् Mfn2या सशर्त विनाश अक्सिडेसन फस्फोरिलेशन (OXthoPHOS) डिसफंक्सनया बांलाक्क मान्यता प्राप्त इन्डक्सन ख। थी-थी न्युरोनल सबटाइप (१६-१९) व थुकिया लिच्वःया न्युरोडिजेनेरेटिभ फेनोटाइप नापं प्रगतिशील न्युरोलोजिकल लक्षण नं खने दु, गथेकि मुभमेन्ट डिसअर्डर (१८, १९) वा सेरिबेलर एटाक्सिया (१६)। लेबल-मुक्त मात्रात्मक (एलएफक्यू) प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिङ, व भाइरोलोजिकल विधिया संयोजन छ्येला झीसं क्यना कि प्रगतिशील न्युरोडिजेनेरेसनं पाइरुभेट कार्बोक्सिलेज (पीसीएक्स) व मेमेगु कारकयात सशक्त रुपं प्रेरित याइ गुकिलिं पीएनया आर्टेरिओस्क्लेरोसिसय् संलग्न जुइ इन भिभो The expression of enzymes। थ्व लूया प्रासंगिकतायात प्रमाणित यायेत, जिमिसं विशेष रुपं Mfn2-अभाव दूगु PNs य् PCxया अभिव्यक्तियात डाउन-रेगुलेट याना, व थ्व अपरेशनं अक्सिडेटिभ तनावयात अप्वयेकीगु व न्युरोडिजेनेरेसनयात तीव्रता बिइगु लुइका, गुकिलिं एजोस्पर्मियां कोष मृत्यु मेटाबोलिक अनुकूलनशीलता प्रदान याइ धकाः प्रमाणित याना। एमएफएन२या गम्भीर अभिव्यक्तिं गम्भीर अक्सफोसया कमी, माइटोकन्ड्रियाल डीएनएया तःधंगु खपत, व स्पष्ट रुपं स्यंगु माइटोकन्ड्रियाल नेटवर्क दूगु टर्मिनल डिजेनेरेसन पीएनयात पूर्ण रुपं उद्धार यायेफु, गुकिलिं थ्व खँय् अझ बः बी कि न्युरोडिजेनेरेसनया थ्व रुपय् कोष ल्वेया उन्नत चरणय् नं रिकभर जुइफु।
Mfn2 नकआउट PNs य् माइटोकन्ड्रियाया कल्पना यायेत जिमिसं छगू माउस स्ट्रेन छ्यला Cre-निर्भर माइटोकन्ड्रियायात ह्याउँगु फ्लोरोसेन्ट प्रोटिन (YFP) (mtYFP) (२०) Cre अभिव्यक्तियात लक्षित यायेत अनुमति बी व इन भिभोय् माइटोकन्ड्रियाया आकृतिया जाँच याना। जिमिसं PNs य् Mfn2 जीनया विनाशं माइटोकन्ड्रियाल नेटवर्कया क्रमिक विभाजन जुइगु खने दु (चित्र S1A), व दकलय् न्हापांगु हिउपाः ३ वाःया उमेरय् खने दु। थ्व स्वया क्याल्बिन्डिन इम्युनोस्टेनिङया क्षतिं प्रमाणित कथं पीएन सेल लेयरया पर्याप्त अपघटन १२ वाःया उमेरय् तक्क शुरु मजू (चित्र १, ए व बी)। माइटोकन्ड्रियाया आकृति विज्ञानय् दकलय् न्हापांगु हिउपाः व न्युरोनल मृत्युया खनेदइगु शुरुवात दथुइ ईया असंगतिं कोष मृत्यु न्ह्यः माइटोकन्ड्रियाया डिसफंक्सनं ब्वलनीगु मेटाबोलिक हिउपाःया अनुसन्धान यायेत प्रेरित यात। जिमिसं वाईएफपी (वाईएफपी+)-व्यक्त याइगु पीएन (चित्र १सी) अलग यायेत फ्लोरोसेन्स-सक्रिय सेल सर्टिङ (एफएसीएस)-आधारित रणनीति विकास याना, व नियन्त्रण मुस्याय् (एमएफएन२ + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), थन लिपा एसटी१बीआरएल (चित्र) धकाः धाइ। वाईएफपी संकेतया सापेक्ष तीव्रताया आधारय् गेटिङ रणनीतिया अनुकूलनं झीसं गैर-पीएन (वाईएफपीनेग) (चित्र एस १ बी) वा पुटेटिभ फ्लोरोसेन्ट एक्सन/डेन्ड्रिटिक टुक्रा (वाईएफपी एस १ डी, कन्फर्मिकल बाइचित्र १ डी, कन्फोर्मिकल), पीएनया वाईएफपी + बडी (वाईएफपीहाइग)यात शुद्ध यायेत अनुमति बी। वर्गीकृत जनसंख्याया म्हसीका प्रमाणित यायेत जिमिसं एलएफक्यू प्रोटिओमिक्स व अनंलि प्रिन्सिपल कम्पोनेन्ट विश्लेषण याना, व YFPhigh व YFPneg कोष दथुइ स्पष्ट पृथक्करण दूगु खनेदत (चित्र S1C)। YFPhigh कोषं ज्ञात PNs मार्कर (अर्थात Calb1, Pcp2, Grid2 व Itpr3)या शुद्ध समृद्धि क्यंगु दु (२१, २२), तर सामान्यतया न्युरोन वा मेमेगु कोष प्रकारय् अभिव्यक्त जुइगु प्रोटिनया छुं नं समृद्धि मदु (चित्र १D) )। स्वतन्त्र प्रयोगय् संकलन यानातःगु वर्गीकृत YFPhigh कोषय् नमूनाया दथुइ तुलना यायेबलय् सहसंबंध गुणांक> ०.९ खने दु, गुकिलिं जैविक प्रतिकृति दथुइ बांलाःगु प्रतिलिपि क्षमता क्यन (चित्र S1E)। सारांशय्, थुगु तथ्यांकं सम्भाव्य पिएनया तीव्र व विशिष्ट अलगावया निंतिं जिमिगु योजनायात मान्यता बिल । थुकियात एल ७-क्रे ड्राइभर सिस्टमं प्रसव लिपाया न्हापांगु वालय् मोजाइक पुनर्संयोजन प्रेरित याइगु जूगुलिं (२३) जिमिसं सीटीआरएल व कन्डिसनल (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) मुस्यायात स्यायेगु शुरु यानागु खः । पुनर्संयोजन पूवनेधुंकाः, थुकियात ४ वाः दुबलय् Mfn2cKO धाइ । अन्तिम बिन्दुया रुपय् जिमिसं ८ वाःया उमेर ल्ययागु खः गुबलय् स्पष्ट माइटोकन्ड्रियाया टुक्रात दुसां नं पीएन तह अझ नं अक्षुण्ण जुयाच्वंगु खः (चित्र १ ख व चित्र एस १ ए) । मुक्कं, जिमिसं मुक्कं ३०१३ प्रोटिनया परिमाणित याना, गुकिलि करिब २२% माइटोकन्ड्रिया (चित्र १E) (चित्र १E) (२४) कथं माइटोकन्ड्रियाल प्रोटिओमया आधारय् माइटोकार्टा २.० एनोतेसनय् आधारित जुल। ८गु वालय् याःगु डिफरेन्सियल जीन एक्सप्रेसन एनालिसिसं सकल प्रोटिनया १०.५% जक्क उल्लेखनीय हिउपा खने दु (चित्र १एफ व चित्र एस१एफ), गुकिलि १९५ प्रोटिन डाउन-रेगुलेट जुल व १२० प्रोटिन अप-रेगुलेट जुल (चित्र १एफ)। थ्व खँ लुमंकेबहःजू कि थ्व तथ्यांक सेटया “अभिनव मार्ग विश्लेषण”ं क्यंगु दु कि विभेदक रुपं अभिव्यक्त जुइगु जीन मुख्यतः विशिष्ट मेटाबोलिक मार्गया प्रतिबन्धित सेटय् ला (चित्र १जी)। रोचक खँ छु धाःसा, OXPHOS व क्याल्सियम सिग्नलिङलिसे स्वापू दूगु लँपुया डाउन-रेगुलेसनं फ्युजन-अभाव दूगु पीएनय् माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया इन्डक्सनया पुष्टि याइ, तर मेमेगु श्रेणी गुकिलि मू रुपं एमिनो एसिड मेटाबोलिज्म दुथ्याइ, उल्लेखनीय रुपं अप-रेगुलेट जुइ, गुगु जुइगु माइटोड्रियन मेटाबोलिज्म PN नापं मेल खनी। रिवाइरिङ्ग स्थीर जू । असफलता।
(क) सीटीआरएल व एमएफएन२सीकेओ मुस्याया सेरिबेलर खण्डया प्रतिनिधि कन्फोकल किपा गुकिलिं पीएनया प्रगतिशील क्षति क्यनाच्वंगु दु (क्याल्बिन्डिन, ग्रे); न्यूक्लियसयात डिएपिआइलिसे काउन्टरस्टेन याःगु खः । (ख) (क) या मात्रा निर्धारण (भेरिएन्सया एकतर्फी विश्लेषण, ***P<0.001; n = ४ निसें ६ वृत्त स्वंगू चूहापाखें)। (सि) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह । (डी) पुर्किन्जे (शीर्ष) व अन्य कोष प्रकार (दथुइ) विशिष्ट मार्करया ताप नक्सा वितरण। (इ) वर्गीकृत पिएनय् म्हसीकातःगु माइटोकन्ड्रियाल प्रोटिनया ल्याः क्यनाच्वंगु भेन डाइग्राम । (एफ) ८ वालय् Mfn2cKO न्यूरॉन्सय् भिन्न रुपं अभिव्यक्त प्रोटिनया ज्वालामुखी प्लाट (१.३ या महत्व कट-अफ मूल्य)। (जी) रचनात्मकता मार्ग विश्लेषणं ८ वाःया रुपय् वर्गीकृत Mfn2cKO PN य् ५ गू दकलय् महत्वपूर्ण अप-रेगुलेसन (लाल) व डाउन-रेगुलेसन (नीला) मार्ग क्यनाच्वंगु दु। प्रत्येक लुयावःगु प्रोटिनया औसत अभिव्यक्ति स्तर क्यनातःगु दु । ग्रेस्केल क्वाःगु नक्सा : समायोजित पि भ्यालु । एनएस, महत्वपूर्ण मखु ।
प्रोटिओमिक्स तथ्यांकं कम्प्लेक्स I, III, व IV या प्रोटिन अभिव्यक्ति बुलुहुँ म्हो जुयाच्वंगु क्यंगु दु । कम्प्लेक्स I, III, व IV फुक्कं आवश्यक mtDNA-एन्कोडेड सबयुनिट दु धाःसा कम्प्लेक्स II, गुकिलि न्यूक्लियर-कोडेड जक्क दु, मूलतः अप्रभावित जुल (चित्र २A व चित्र S2A)। । प्रोटिओमिक्सया लिच्वःलिसे मेल खनीगु सेरिबेलर टिस्यू सेक्सनया इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीं क्यंगु दु कि पीएनय् कम्प्लेक्स IV या एमटीसीओ १ (माइटोकन्ड्रियाल साइटोक्रोम सी अक्सिडेज सबयुनिट १) सबयुनिट स्तर बुलुहुँ म्हो जुयाच्वंगु दु (चित्र २ ख) । mtDNA-एन्कोडेड सबयुनिट Mtatp8 यक्व म्हो जुल (चित्र S2A), धाःसा न्यूक्लियर-एन्कोडेड एटीपी सिन्थेज सबयुनिटया स्थिर-अवस्था स्तर अपरिवर्तित जुल, गुगु mtDNA अभिव्यक्ति स्थिर जुइबलय् ज्ञात स्थिर एटीपी सिन्थेज सबएसेम्बली F1 कम्प्लेक्सनाप मेल खनि। गठन स्थीर जू । पंगः (७) रियल टाइम पोलिमरेज चेन रिएक्सन (qPCR)पाखें क्रमबद्ध Mfn2cKO PNs य् mtDNA स्तरया मूल्यांकनं mtDNA प्रतिलिपि ल्याः क्रमिक रुपं म्हो जूगु पुष्टि याःगु दु । नियन्त्रण समूहया तुलनाय् ८ वाःया उमेरय् mtDNA स्तरया करिब २०% जक Was retained जुल (चित्र २C)। थ्व लिच्वः नापं मेल खनिगु कथं, डीएनए लुइकेत Mfn2cKO PNs या कन्फोकल माइक्रोस्कोपी स्टेनिङं माइटोकन्ड्रियाल न्युक्लियोटाइडया ई-निर्भर खपत क्यनि (चित्र २D)। जिमिसं माइटोकन्ड्रियाल प्रोटिन अपघटन व तनाव प्रतिक्रियाय् संलग्न छुं उम्मेदवारत जक्क अप-रेगुलेट जूगु लुइका, गुकिलि Lonp1, Afg3l2 व Clpx, व OXPHOS कम्प्लेक्स एसेम्बली कारक ला। एपोप्टोसिसय् दुथ्याइगु प्रोटिनया स्तरय् छुं नं उल्लेखनीय हिउपाः खने मदु (चित्र S2B)। अथे हे जिमिसं क्याल्सियम ढुवानीइ संलग्न माइटोकन्ड्रिया व एन्डोप्लाज्मिक रेटिक्युलम च्यानलय् चिधंगु हिउपाः जक खनेदत (चित्र S2C)। थ्व नापं, अटोफेजी-सम्बन्धी प्रोटिनया मूल्यांकनय् छुं नं महत्त्वपूर्ण हिउपा मलू, गुगु इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री व इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपीं इन भिभोय् अवलोकन याःगु अटोफेगोसोमया दृश्यमान इन्डक्सननाप मेल खनि (चित्र S3)। अथे जुसां पीएनय् प्रगतिशील ओक्सफोस डिसफंक्सन स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकन्ड्रियाल हिउपा नापं जुइ। ५ व ८ वाःया उमेरया Mfn2cKO PNsया कोष शरीर व डेन्ड्रिटिक ट्रीइ माइटोकन्ड्रियाल क्लस्टर खने दइ, व दुनेया झिल्ली संरचनाय् गम्भीर हिउपाः वःगु दु (चित्र S4, A व B)। थ्व अल्ट्रास्ट्रक्चरल हिउपा व mtDNA य् उल्लेखनीय कमी नापं मेल खनिगु कथं टेट्रामेथाइलरोडामिन मिथाइल एस्टर (TMRM) दूगु तीव्र सेरेब्रल सेरिबेलर स्लाइसया विश्लेषणं Mfn2cKO PNs य् माइटोकन्ड्रियाल मेम्ब्रेन पोटेंशियल उल्लेखनीय रुपं म्हो जूगु खनेदु (चित्र S4C)।
(ए) अक्सफोस कम्प्लेक्सया अभिव्यक्ति स्तरया ई कोर्स विश्लेषण। ८ वालय् P<0.05 दुगु प्रोटिनयात जक बिचाः या (निगू-तरफा ANOVA)। बिन्दु दुगु ध्वः : सिटिआरएलया तुलनाय् छुं समायोजन मजू । (B) खव: एन्टि-एमटीसीओ१ एन्टिबडी (स्केल बार, २० μm) नापं लेबल यानातःगु सेरिबेलर सेक्सनया छगू दसु। पुर्किन्जे सेल बडिं कब्जा यानातःगु थाय् म्हासुगु रंगं त्वपुया तःगु दु । दायाँ: एमटीसीओ १ स्तरया मात्रा निर्धारण (भेरिएन्सया एकतर्फी विश्लेषण; n = ७ निसें २० कोष स्वंगु मुस्यापाखें विश्लेषण यानातःगु)। (सी) क्रमबद्ध पीएनय् mtDNA प्रतिलिपि संख्याया qPCR विश्लेषण (भेरिएन्सया एकतर्फी विश्लेषण; n = 3 निसें 7 चूहा)। (डी) बायाँ: एन्टि-डीएनए एन्टिबडी (स्केल बार, २० μm) नापं लेबल यानातःगु सेरिबेलर स्लाइसया दसु। पुर्किन्जे सेल बडिं कब्जा यानातःगु थाय् म्हासुगु रंगं त्वपुया तःगु दु । दायाँ: mtDNA घाःया मात्रा निर्धारण (भेरिएन्सया एकतर्फी विश्लेषण; n = स्वंगु मुस्याया ५ निसें ९ कोष)। (E) छगू तीव्र सेरिबेलर खण्डया छगू दसु गुकिलिं माइटोवाईएफपी + पुर्किन्जे कोष (तीर) क्यनाच्वंगु छगू पूर्ण कोष प्याच क्ल्याम्प रेकर्डिङय्। (एफ) आइभि वक्रया मात्रा निर्धारण । (जी) सीटीआरएल व एमएफएन२सीकेओ पुर्किन्जे कोशिकाय् डिपोलाराइजिंग करेन्ट इन्जेक्सनया प्रतिनिधि अभिलेख। शीर्ष ट्रेस : एपीयात ट्रिगर याःगु न्हापांगु पल्स । क्वय् या ट्रेस : दकलय् अप्वः एपि फ्रिक्वेन्सी । (ज) पोस्टसिनाप्टिक स्वतःस्फूर्त इनपुट (एसपीएसपी) या मात्रा निर्धारण। प्रतिनिधि रेकर्डिङ्ग ट्रेस व थुकिया जूम रेसियो (I) य् क्यनातःगु दु । भेरिएन्सया एकतर्फी विश्लेषणं स्वम्ह छुँया n = ५ निसें २० कोषया विश्लेषण यात। तथ्यांकयात औसत ± SEM कथं व्यक्त याइ; * पि <०.०५; **पि<०.०१; ***पि<०.००१ (जे) पर्फोरेटेड प्याच क्लाम्प मोड छ्यलाः रेकर्ड यानातःगु स्वतःस्फूर्त एपीया प्रतिनिधि चिं । शीर्ष ट्रेस : अधिकतम एपी फ्रिक्वेन्सी । क्वय् या ट्रेस : छगू एपिया जूम । (के) (जे) कथं औसत व अधिकतम एपी फ्रिक्वेन्सीया परिमाणन या । मान-व्हिटनी परीक्षण; n = ५ गू कोष प्यम्ह छुँपाखें विश्लेषण याःगु खः । तथ्यांकयात औसत ± SEM कथं व्यक्त याइ; महत्वपूर्ण मखु ।
८ वाःया Mfn2cKO PN य् स्पष्ट OXPHOS क्षति खनेदूगु खः, गुकिं न्युरोनया शारीरिक ज्या तसकं असामान्य जूगु संकेत बी । अथे जुया जिमिसं तीव्र सेरिबेलर स्लाइसय् होल-सेल प्याच क्ल्याम्प रेकर्डिङ यानाः ४ निसें ५ वालय् व ७ निसें ८ वालय् अक्सफोस-अभाव दूगु न्युरोनया निष्क्रिय विद्युतीय विशेषताया विश्लेषण याना (चित्र २ई)। अप्रत्याशित रुपं Mfn2cKO न्युरोनया औसत रेस्टिङ मेम्ब्रेन पोटेंशियल व इनपुट रेजिस्टेन्स नियन्त्रणया थें हे खने दु, यद्यपि कोष दथुइ सूक्ष्म भिन्नता खनेदु (तालिका १)। अथे हे ४ निसें ५ वाःया उमेरय् करेन्ट-भोल्टेज सम्बन्ध (IV कर्भ)य् छुं नं उल्लेखनीय हिउपाः खने मदु (चित्र २एफ) । तर ७ निसें ८ वाः पुलांगु छुं नं Mfn2cKO न्युरोन IV रेजिमेन (हाइपरपोलाराइजेसन स्टेप)ं म्वानाच्वंगु मदु, गुकिलिं थ्व लिपांगु चरणय् हाइपरपोलाराइजेसन सम्भावनाया स्पष्ट संवेदनशीलता दूगु संकेत बी। थ्व स्वया Mfn2cKO न्युरोनय् रिपिटिभ एक्सन पोतेन्सियल (AP) डिस्चार्ज जुइगु डिपोलाराइजिंग करेन्ट बांलाक्क सहन जुइ, गुकिलिं इमिगु समग्र डिस्चार्ज प्याटर्न ८ वाःया नियन्त्रण न्युरोन स्वया उल्लेखनीय रुपं फरक मजूगु संकेत बी (तालिका १ व चित्र २जी)। अथे हे स्वतःस्फूर्त पोस्टसिनाप्टिक करेन्ट (sPSCs)या आवृत्ति व आयाम नियन्त्रण समूहया आवृत्तिलिसे तुलना यायेबहःजू, अले घटनाया आवृत्ति ४ वाःनिसें ५ वाःतक ७ वाःनिसें ८ वाःतक अप्वःगु नापं उलि हे वृद्धि जूगु खः (चित्र २, एच व I) । पिएनएसय् सिनाप्टिक परिपक्वताया ई (२५) । पर्फोरेटेड पिएनएस प्याच लिपा नं अज्याःगु हे लिच्वः पिहां वल । थ्व कन्फिगरेसनं सेलुलर एटीपी दोषया सम्भावित क्षतिपूर्तियात पनेफु, गथेकि होल-सेल प्याच क्लाम्प रेकर्डिङय् जुइफु। विशेष यानाः Mfn2cKO न्युरोनया रेस्टिङ मेम्ब्रेन पोटेंशियल व स्पोन्टेनियस फायरिंग फ्रिक्वेन्सी प्रभावित मजू (चित्र २, जे व के)। सारांशय्, थ्व लिच्वःतेसं स्पष्ट ओक्सफोस डिसफंक्सन दूगु पीएनतेसं उच्च-आवृत्ति डिस्चार्ज प्याटर्नयात बांलाक्क सामना यायेफुगु संकेत बी, गुकिलिं छगू क्षतिपूर्ति संयन्त्र दु गुकिलिं इमित निकट-सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल प्रतिक्रियात कायम यायेत अनुमति बी।
तथ्यांकयात औसत ± SEM (भेरिएन्सया एकतर्फी विश्लेषण, होल्म-सिदाकया बहु तुलना परीक्षण; *P<0.05)या रुपय् व्यक्त याइ। यूनिट ल्याःयात ब्राकेतय् क्यनातःगु दु ।
जिमिसं प्रोटिओमिक्स डाटासेट (चित्र १जी)य् छुं नं श्रेणीइ गम्भीर अक्सफोसया कमीयात प्रतिकार यायेफइगु लँपुत दु कि मदु धकाः अनुसन्धान यायेत न्ह्यचिला, गुकिलिं प्रभावित पीएनं छाय् निकट-सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलोजी (चित्र २, ई निसें के) कायम यायेफइ धकाः व्याख्या याना। । प्रोटिओमिक्स विश्लेषणं क्यंगु दु कि शाखायुक्त श्रृंखला एमिनो एसिड (BCAA)या क्याटाबोलिज्मय् संलग्न एन्जाइमत यक्व अप-रेगुलेट जुइ (चित्र ३A व चित्र S5A), व अन्तिम उत्पाद एसिटाइल-CoA (CoA) वा सुक्सिनिल CoA आर्टेरिओक्लेरोसिस (TCA)य् ट्राइकार्बोक्सिलेट्सया पूरक जुइफु। जिमिसं बिसिएए ट्रान्समिनेज १ (बिसिएटि१) व बिसिएटि२ निगुलिं अप्वःगु खना । इमिसं α-केटोग्लुटारेटं ग्लुटामेट दयेका बीसीएए क्याटाबोलिज्मया न्हापांगु चरणयात उत्प्रेरित यात (२६)। शाखायुक्त श्रृंखला केतो एसिड डिहाइड्रोजेनेज (बीसीकेडी) कम्प्लेक्स दयेकिगु फुक्क सबयुनित अपरेगुलेट जुइ (थ्व कम्प्लेक्सं लिच्वःया बीसीएए कार्बन कंकालया लिपाया व अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्सिलेसनयात उत्प्रेरित याइ) (चित्र ३ए व चित्र एस५ए)। तर क्रमबद्ध पीएनय् बीसीएएय् हे छुं स्पष्ट हिउपाः मलू, गुकिया कारण थ्व आवश्यक एमिनो एसिडया सेलुलर अपतेक अप्वःगु वा टिसीए चक्रया पूरकया निंतिं मेमेगु स्रोत (ग्लुकोज वा ल्याक्टिक एसिड)या छ्येलेज्या जुइफु (चित्र एस५बी)। ओक्सफोस मदुगु पीएनतेसं नं ८ वाःया उमेरय् ग्लुटामिन अपघटन व ट्रान्समिनेसनया गतिविधि अप्वइगु खनेदु, गुकियात माइटोकन्ड्रियाल एन्जाइम ग्लुटामिनेज (जीएलएस) व ग्लुटामिन पाइरुभेट ट्रान्समिनेज २ (जीपीटी२)या अप-रेगुलेसनं प्रतिबिम्बित यायेछिं (चित्र ३, ए व सी)। थ्व खँ लुमंकेबहःजू कि जीएलएसया अप-रेगुलेसन स्प्लाइस्ड आइसोफर्म ग्लुटामिनेज सी (जीएलएस-जीएसी)य् सीमित जुइ (Mfn2cKO/CTRLया हिउपा करिब ४.५-गुणा, P = ०.०५ जुइ), व क्यान्सरया टिसुइ थुकिया विशिष्ट अप-रेगुलेसनं माइटोनरजाइन्ड्रियालयात समर्थन यायेफु। (२७)
(ए) हिट म्यापं ८ वालय् निर्दिष्ट रुटया निंतिं प्रोटिनया स्तरय् गुणा हिउपाः क्यनी । (बि) एन्टि-पिसिएक्स एन्टिबडी (स्केल बार, २० माइक्रोमिटर) नापं लेबल यानातःगु सेरिबेलर स्लाइसया दसु। म्हासुगु बाणं पुर्किन्जे कोषया म्हयात क्यनी । (C) एथेरोस्क्लेरोसिसया निंतिं छगू महत्वपूर्ण उम्मेदवारया रुपय् म्हसीकातःगु टाइम कोर्स प्रोटिन एक्सप्रेसन विश्लेषण (मल्टिपल टी-टेस्ट, *एफडीआर <5%; n = 3-5 मुस्या)। (डी) च्वय् : [१-१३सी]पाइरुभेट ट्रेसरय् दूगु लेबल यानातःगु कार्बन दुहां वनेगु थी-थी कथं क्यनातःगु छगू स्कीमेटिक डायग्राम (अर्थात, पीडीएच वा ट्रान्स-आर्टेरियल रुटया माध्यमं)। क्वय् : भ्वायलिन चार्टय् [१-१३C]पाइरुभेट (पेयर t-test; ** P <0.01) नापं तीव्र सेरिबेलर स्लाइसयात लेबल यायेधुंका एस्पार्टिक एसिड, साइट्रिक एसिड व मालिक एसिडय् हिलेगु सिंगल-लेबल कार्बन (M1)या प्रतिशत क्यनातःगु दु। (इ) क्यनातःगु लँपुया ब्यापक ई इतिहास विश्लेषण । ८ वालय् P<0.05 दुगु प्रोटिनयात जक बिचाः या । ड्यास लाइन: समायोजन मूल्य मदु (भेरिएन्सया निगु-तरफा विश्लेषण; * P <0.05; *** P <0.001)। डाटायात मीन±एसइएमकथं क्यनी ।
जिमिगु विश्लेशणय्, बिसिएए क्याटाबोलिज्म मू अप-रेगुलेसन लँपुइ छगू जुयाच्वंगु दु । थ्व तथ्यं अक्सफोस मदुगु पीएनय् टिसिए चक्रय् दुहां वइगु भेन्टिलेसन भ्यालुम हिलेफु धकाः क्वात्तुक सुझाव बियाच्वंगु दु । थ्व न्युरोनल मेटाबोलिक रिवाइरिङया छगू मू रुपया प्रतिनिधित्व यायेफु, गुकिलिं गम्भीर अक्सफोस डिसफंक्सनया मर्मतया इलय् न्युरोनल फिजियोलोजी व अस्तित्वय् प्रत्यक्ष प्रभाव लाकेफु। थ्व परिकल्पनाया अनुरूप, जिमिसं लुइका कि मू एन्टि-एथेरोस्क्लेरोटिक एन्जाइम PCx अप-रेगुलेट जुइ (Mfn2cKO/CTRL करिब १.५ गुणा हिलाच्वनि; चित्र ३A), गुकिलिं पाइरुभेटयात रिक्सालोएसिटेट (२८)य् हिलेगु ज्यायात उत्प्रेरित याइ, गुकिलिं टिसुट्सयात ब्रा, २८ य् दूगु विश्वास याइ। ३०)। प्रोटिओमिक्सया लिच्वः नापं मेल खनिगु कथं कन्फोकल माइक्रोस्कोपीं क्यंगु दु कि ओक्सफोस-अभाव दूगु पीएनय् पीसीएक्स अभिव्यक्ति विशेष व उल्लेखनीय रुपं अप्वःगु खने दु धाःसा पीसीएक्स रिएक्टिभिटी मुख्यतः नियन्त्रणया लिक्कया बर्गम्यान ग्लियल सेलय् जक सीमित जूगु खनेदु (चित्र ३ ख)। पीसीएक्सया अवलोकित अपरेगुलेसनयात कार्यात्मक रुपं परीक्षण यायेत जिमिसं तीव्र सेरिबेलर स्लाइसयात [१-१३सी]पाइरुभेट ट्रेसरं वासः याना। जब पाइरुभेटयात पाइरुभेट डिहाइड्रोजेनेज (PDH)ं अक्सिडाइज याइ, थुकिया आइसोटोप लेबल मदया वन , तर पाइरुभेटयात भास्कुलर रिएक्सनं मेटाबोलाइज याइबलय् टिसीए चक्रया इन्टरमिडिएटय् दुथ्याकिगु या (चित्र ३डी)। जिमिगु प्रोटिओमिक्स तथ्यांकया समर्थनय् जिमिसं Mfn2cKO स्लाइसया एस्पार्टिक एसिडय् थ्व ट्रेसरपाखें यक्व ल्याखय् मार्कर अवलोकन याना, धाःसा साइट्रिक एसिड व म्यालिक एसिडय् नं मध्यम प्रवृत्ति दु, अथे जुसां उल्लेखनीय मजू (चित्र ३डी)।
माइटोकन्ड्रियाल ट्रान्सक्रिप्सन फ्याक्टर ए जीन (Tfam) (चित्र S6B) (चित्र S6B) यात स्यंकेगु कारणं माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सन दुपिं माइटोपार्क मुस्याया डोपामिन न्युरोनय् PCx अभिव्यक्ति नं उल्लेखनीय रुपं अप-रेगुलेट जूगु खः (31), गुकिं संकेत याइ कि एसिटोन एसिड डिसफंक्सन डुकर्नस्क्लेरोसिस द म्हय् अक्सफोस । थ्व खँ लुमंकेबहःजू कि थ्व लुयावःगु दु कि आर्टेरिओस्क्लेरोसिसलिसे स्वापू दूगु न्युरोनय् अभिव्यक्त जुइफुगु अद्वितीय एन्जाइम (३२-३४) ओक्सफोसया अभाव दूगु पीएनय् उल्लेखनीय रुपं अप-रेगुलेट जुइ, गथेकि प्रोपिओनिल-सीओए कार्बोक्सिलेज (पीसीसी-ए), मालोनिल-सीओए-माइटोनिल-माइटोकियनल प्रोपियोनिल-सीओए-माइटोकॉनल टु कन्भर्ट जुइ । एन्जाइम ३ (ME3), गुकिया मू भूमिका मालेटं पाइरुभेट रिकभर यायेगु ख (चित्र ३, ए व सी) (३३, ३५)। थ्व नापं, जिमिसं Pdk3 एन्जाइमय् उल्लेखनीय वृद्धि खना, गुकिलिं फस्फोरिलेशन याइ व थुकिलिं PDHयात निष्क्रिय याइ (36), धाःसा Pdp1 एन्जाइमय् सक्रिय याइगु Pdp1 एन्जाइम वा PDH एन्जाइम कम्प्लेक्सय् हे छुं नं हिउपाः खने मदु (चित्र ३A)। लगातार, Mern2cKO PNs य्, Ser293 (PDH या एन्जाइम गतिविधियात निरोध यायेत ज्ञात)य् PDH कम्प्लेक्सया पाइरुभेट डिहाइड्रोजेनेज E1 घटकया α1 सबयुनिट α (PDHE1α) सबयुनिटया फस्फोरिलेशन अप्वया वःगु ख ( चित्र S6C) (चित्र S6)। पाइरुभेटयाके भास्कुलर एक्सेस मदु ।
अन्तय्, जिमिसं लुइका कि सेरिन व ग्लाइसिन बायोसिन्थेसिसया सुपर पथवे, स्वापू दूगु माइटोकन्ड्रियाल फोलेट (१सी) चक्र व प्रोलिन बायोसिन्थेसिस (चित्र १जी व चित्र एस५सी) फुक्कं उल्लेखनीय रुपं अप-रेगुलेट जुइ, रिपोर्ट कथं, सक्रियता प्रक्रियाया झ्वलय्। माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सन (५-७) नापं जःखःया टिस्यू सक्रिय जुइ । थ्व प्रोटिओमिक्स तथ्यांकयात समर्थन याइगु कन्फोकल विश्लेषणं क्यंगु दु कि ओक्सफोस मदूगु पीएनय् ८ वाःया मुस्याया सेरिबेलर स्लाइसयात माइटोकन्ड्रियाल फोलेट चक्रया मू एन्जाइम सेरिन हाइड्रोक्सीमेथाइलट्रान्सफेरेज २ (एसएचएमटी२)या अधीनय् तःगु ख। महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (किपा S5D) १३गु सीयू-ग्लुकोज-इन्क्युबेटेड एक्युट सेरिबेलर स्लाइसय् मेटाबोलिक ट्रेसिङ प्रयोगं सेरिन व प्रोलिन बायोसिन्थेसिसया अप-रेगुलेसनयात अझ पुष्टि याःगु दु, गुकिलिं कार्बन आइसोफर्मया सेरिन व प्रोलिनय् फ्लक्स अप्वःगु संकेत बी (चित्र S5E)। जीएलएस व जीपीटी२ पाखें प्रवर्द्धन जूगु प्रतिक्रियात ग्लुटामिनं ग्लुटामेटया संश्लेषण व ग्लुटामेट व α-केटोग्लुटारेट दथुइ ट्रान्समिनेशनया निंतिं जिम्मेवार जुइगुलिं इमिगु अपरेगुलेसनं OXPHOS-अभाव दूगु न्यूरन्सय् ग्लुटामेटया अप्वःगु माग दु धकाः संकेत बी , थ्व अप्वःगु proureline Staureline (Fig5) या उद्देश्य कायम यायेगु जुइफु। थ्व हिउपाया विपरीत, PN-विशिष्ट Mfn2cKO मुस्याया सेरिबेलर एस्ट्रोसाइट्सया प्रोटिओमिक विश्लेषणं क्यंगु दु कि थ्व लँपु (फुक्क एन्टिपेरोक्सिडेज नापं) अभिव्यक्तिइ उल्लेखनीय हिउपाः मवः, गुकिलिं थ्व मेटाबोलिक पुनर्निर्देशन क्षयग्रस्त PN (चित्र S6)या निंतिं चयनात्मक जूगु क्यन।
सारांशय्, थ्व विश्लेषणं पीएनय् विशिष्ट मेटाबोलिक लँपुया टेम्पोरल सक्रियताया उल्लेखनीय रुपं फरक प्याटर्न लुइकल। असामान्य न्युरोनल माइटोकन्ड्रियाल फंक्सनं प्रारम्भिक एथेरोस्क्लेरोसिस व १सी रिमोडेलिङ (चित्र ३ई व चित्र एस५सी) जुइफुसां I व IV कम्प्लेक्सया अभिव्यक्तिइ अनुमानित हिउपाः तकं जुइफुसां सेरिन डी नोभो संश्लेषणय् हिउपाः जक्क It only became apparent in the late sta ges। अक्सफोस डिसफंक्सन (किपा ३इ व किपा एस५सि) थ्व लूतेसं छगू क्रमिक प्रक्रियायात परिभाषित याइ गुकिलि तनाव-प्रेरित माइटोकन्ड्रियाल (१C चक्र) व साइटोप्लाज्मिक (सेरिन बायोसिन्थेसिस) टिसीए चक्रय् एथेरोस्क्लेरोसिस अप्वइगुलिं न्युरोनल मेटाबोलिज्मयात पुनःआकार बीत सिनर्जिस्टिक प्रतिक्रिया बी।
८-वाः पुलांगु ओक्सफोस-अभाव दूगु पीएनं उच्च-आवृत्ति उत्तेजना गतिविधि कायम यायेफु व माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया क्षतिपूर्तिया निंतिं महत्त्वपूर्ण मेटाबोलिक पुनःसंयोजन जुइफु। थ्व लुइकेज्यां छगू रोचक सम्भावना ब्वलंकी कि थ्व इलय् नं थ्व कोषतेसं नं न्युरोडिजेनेरेसनयात लिपा लाकेत वा पनेगु निंतिं चिकित्सीय हस्तक्षेप प्राप्त यायेफु। लिपागु। जिमिसं निगू स्वतन्त्र हस्तक्षेपया माध्यमं थुगु सम्भावनायात समाधान याना । न्हापांगु विधिइ जिमिसं Cre-निर्भर एडेनो-सम्बन्धी भाइरस (AAV) भेक्टोर डिजाइन याना गुकिलिं MFN2 यात OXPHOS-अभाव दूगु PNs इन भिभोय् चयनात्मक रुपं व्यक्त यायेफइ (चित्र S7A)। एएभी एन्कोडिङ एमएफएन२ व फ्लोरोसेन्ट रिपोर्टर जीन एमचेरी (एमएफएन२-एएभी) प्राथमिक न्युरोन कल्चरय् इन भिट्रोय् प्रमाणित जुल, गुकिलिं एमएफएन२यात क्रे-निर्भर कथं अभिव्यक्त याइ व माइटोकन्ड्रियाल मोर्फोलोजीयात उद्धार यात, गुकिलिं एमएफएनएस डीकेओ, बी फिगर एस७) न्युरोन्युतेसनयात पनेफु। थ्व धुंका, जिमिसं ८ वाःया Mfn2-AAV यात Mfn2cKO व नियन्त्रण मुस्याया सेरिबेलर कर्टक्सय् स्टीरियोट्याक्टिक रुपं थ्यंकेत इन भिभो प्रयोग याना, व १२ वाःया मुस्याया विश्लेषण याना (चित्र ४ ए)। उपचार यानातःगु Mfn2cKO छुँत सित (चित्र १, ए व बी) (१६)। भाइरल ट्रान्सडक्सन इन भिभोया लिच्वः कथं छुं सेरिबेलर सर्कलय् पीएनया चयनात्मक अभिव्यक्ति जुइ (चित्र S7, G व H)। एमचेरी (Ctrl-AAV) जक्क व्यक्त याइगु नियन्त्रण एएभीया इन्जेक्सनं Mfn2cKO जनावरय् न्युरोडिजेनेरेसनया डिग्रीइ छुं नं उल्लेखनीय प्रभाव मबिल। थ्व स्वया Mfn2-AAV नापं ट्रान्सड्युस यानातःगु Mfn2cKOsया विश्लेषणं PN सेल लेयरया उल्लेखनीय सुरक्षात्मक प्रभाव क्यंगु दु (चित्र ४, बी व सी)। विशेष यानाः न्युरोन घनत्व नियन्त्रण प्राणी स्वया लगभग छुटे यायेमफइगु खनेदु (चित्र ४, बी व सी, व चित्र एस७, एच व आई)। एमएफएन१या अभिव्यक्ति तर एमएफएन२या अभिव्यक्ति न्युरोनल मृत्युयात बचे यायेत उलि हे प्रभावकारी जुइ (चित्र ४सी व चित्र एस७, सी व एफ), गुकिलिं एक्टोपिक एमएफएन१या अभिव्यक्तिं एमएफएन२या अभावयात प्रभावकारी रुपं पूरक यायेफुगु संकेत बी। एकल पीएन स्तरय् थप विश्लेषणं क्यंगु दु कि एमएफएन२-एएभीं यक्व ल्याखय् माइटोकन्ड्रियाया अल्ट्रास्ट्रक्चरयात उद्धार यात, एमटीडीएनए स्तरयात सामान्यीकरण यात, व एन्टि-एन्जियोजेनेसिस मार्कर पीसीएक्सया उच्च अभिव्यक्तियात उल्टे यात (चित्र ४, सी निसें ई )। आरामया अवस्थाय् उद्धार याःपिं Mfn2cKO मुस्यातय्गु दृश्य निरीक्षणं उमिगु मुद्रा व मोटर लक्षण (आन्दोलन S1 निसें S3) बांलाःगु खनेदूगु खः । निष्कर्षय्, थ्व प्रयोगं क्यनि कि ओक्सफोसय् तच्वःगु कमी दूगु पीएनय् एमएफएन२यात लिबाक्क पुनःप्रवेश एमटीडीएनए खपतयात उल्टे यायेत व एथेरोस्क्लेरोसिसयात प्रेरित यायेत पर्याप्त जुइ, गुकिलिं एक्सोन डिजेनेरेसन व न्युरोनल डेथ इन भिभोय् पनेफु।
(क) संकेतित मेटाबोलिक मार्ग सक्रिय जुइबलय् एएभी एन्कोडिङ एमएफएन२ इन्जेक्सन यायेगु प्रयोगात्मक तालिका क्यनिगु योजना। (ख) १२ हप्ता पुलांगु सेरिबेलर सेक्सनया प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफ Mfn2cKO मुस्यालिसे ट्रान्सड्युस यानाः एन्टि-क्याल्बिन्डिन एन्टिबडीलिसे लेबल यानातःगु दु । जवय् : एक्सन फाइबरया स्केलिङ्ग । एक्सोन जूमया स्केल ४५० व ७५ माइक्रोमिटर खः । (सी) बायाँ: एएभी ट्रान्सडक्सन लूप (एएभी +) में पुर्किन्जे सेल डेन्सिटी का मात्रा निर्धारण (भेरिएन्स का एक-तरफा विश्लेषण; n = 3 चूहा)। दायाँ: १२ वालय् ट्रान्सड्युस्ड पीएनय् mtDNA फोकस विश्लेषण (अनपेयर t-test; n = स्वम्ह मुस्याया ६ कोष)। * पि <०.०५; ** पि <०.०१ (डी) संकेतित भाइरल वेक्टर के साथ ट्रान्सड्यूस Mfn2cKO सेरिबेलर खंड के PNs के प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफ। गुलाबी मास्कं डेन्ड्राइट्सं कब्जा यानातःगु थाय् क्यनि, व ह्याउँगु डट दूगु वर्गं जवय् बियातःगु जूम क्यनि; एनं न्यूक्लियसयात प्रतिनिधित्व याइ । स्केल बार, १μm। (इ) १२ वालय् ट्रान्सड्यूस्ड पिएनय् पिसिएक्स स्टेनिङ्गया दसु क्यनी । स्केल बार, २० μm। ओइ, अति अभिव्यक्ति; एफसि, लथ्या हिलाब्यु ।
अन्तय्, जिमिसं ओक्सफोस डिसफंक्सनया अनुभव याःगु पीएनय् पेरोक्सिडेज-प्रेरित कोषया अस्तित्वया महत्वया अनुसन्धान याना। जिमिसं विशेष रुपं माउस PCx mRNA (AAV-shPCx)यात लक्षित यानाः mCherry एन्कोडिङ AAV-shRNA (शर्ट हेयरपिन RNA) उत्पन्न याना, व Mfn2cKO मुस्याया सेरिबेलमय् भाइरस वा थुकिया स्क्रैम्बल्ड कन्ट्रोल (AAV-scr) इन्जेक्सन याना। पीसीएक्स अभिव्यक्ति अप्वःगु (चित्र ३सी) व पीएन सेल लेयर अझ नं अक्षुण्ण जुयाच्वंगु ई (चित्र १क)या ईलय् प्रभावकारी पीसीएक्स नकदाउन प्राप्त यायेत उमेरया प्यंगूगु वालय् (चित्र ५क) इन्जेक्सन याःगु खः । थुकी लुमंकेबहःजू, पीसीएक्स (चित्र एस८ए) क्वथलेवं पीएन मृत्युया उल्लेखनीय तीव्रता वइ, गुगु संक्रमणया छगू जक प्रतिबन्धित रिंग खः (चित्र ५, बी व सी) । पीसीएक्स अप-रेगुलेसनं प्रेरित मेटाबोलिक प्रभावया संयन्त्र थुइकेत जिमिसं पीसीएक्स नकदाउन धुंका पीएनया रेडक्स स्टेटसया अध्ययन याना व एएभी-मध्यस्थता अप्टिकल बायोसेन्सर Grx1-roGFP2 यात छक्वलं व्यक्त याना (चित्र S8, B to D) ग्लुटाथियोन पोटेन्सिएक्स८ (पेट्चेन्ज८ The relative) या मूल्यांकन यायेत। अनंलि, जिमिसं एफएलआईएम अवस्थाया प्रमाणित यायेधुंका साइटोप्लाज्मिक रेडक्स स्थितिइ सम्भावित हिउपाःया पत्ता लगे यायेत ७ वाः पुलांगु Mfn2cKO वा नियन्त्रण लिटरमेटया तीव्र मस्तिष्क स्लाइसय् निगु फोतोन फ्लोरोसेन्स लाइफटाइम इमेजिङ माइक्रोस्कोपी (एफएलआईएम) याना (चित्र एस८, ई निसें जी)। विश्लेषणं PCx अभिव्यक्ति मदुगु छगू Mfn2cKO PNs या अक्सिडेसन अवस्थाय् उल्लेखनीय वृद्धि क्यंगु दु, गुगु नियन्त्रण न्युरोन वा स्क्रैम्बल्ड shRNA जक अभिव्यक्त याइगु Mfn2cKO PNs स्वया फरक खनेदु (चित्र ५, D व E)। पीसीएक्स अभिव्यक्ति डाउन-रेगुलेट जुइबलय्, तसकं अक्सिडाइज अवस्था क्यनिगु एमएफएन२सीकेओ पीएनया प्रतिशत स्वंगु गुणा स्वया अप्व अप्वइ (चित्र ५ई), गुकिलिं पीसीएक्स अप-रेगुलेसनं डिजेनेरेटेड न्युरोनया रेडक्स क्षमता कायम यानातःगु संकेत बी।
(क) संकेतित मेटाबोलिक मार्ग सक्रिय जुइबलय् एएभी एन्कोडिङ shPCx इन्जेक्सन यायेगु प्रयोगात्मक तालिका क्यनिगु योजना। (ख) ४ हप्ताय् एन्टि-क्याल्सिन्युरिन एन्टिबडीं ट्रान्सड्यूस व लेबल यानातःगु Mfn2cKO मुस्याय् ८ हप्ता पुलांगु सेरिबेलर सेक्सनया प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफ। स्केल बार, ४५०μm। (सी) एएभी-ट्रांसड्यूस्ड लूपय् पुर्किन्जे सेल डेन्सिटीया मात्रा निर्धारण (भेरिएन्सया एकतर्फी विश्लेषण; n = 3 निसें 4 चूहा)। तथ्यांकयात औसत ± SEM कथं व्यक्त याइ; ***पि<०.००१ (डी) प्रतिनिधि एफएलआईएम चित्रं निर्दिष्ट प्रयोगात्मक अवस्थाय् ग्लुटाथियोन रेडक्स सेन्सर Grx1-roGFP2 व्यक्त याइगु ७ वाःया पीएनया औसत आयु क्यनाच्वंगु दु। एलयूटि (लुक-अप टेबल) अनुपात : म्वायेगु ई अन्तराल (पिकोसेकेण्डय्) । स्केल बार, २५μm। (E) हिस्टोग्रामं (D) निसें Grx1-roGFP2 जीवनकालया मूल्यया वितरण क्यनि (प्रत्येक अवस्थाय् निगु मुस्याय् n=158 निसें 368 कोष)। प्रत्येक हिस्टोग्रामया च्वय् च्वंगु पाइ चार्ट: उल्लेखनीय रुपं ताःहाकःगु (लाल, अक्सिडाइज) वा चिहाकःगु (नीलः, म्हो) आयुया मू दूगु कोषया ल्याः क्यनि, गुकिलिं CTRL-AAV-scr य् औसत आयुया मूया १ SD स्वया अप्व जुइ। (एफ) प्रस्तावित मोडेलं न्यूरोनल पिसिएक्सया अपरेगुलेसनया सुरक्षात्मक प्रभाव क्यनी ।
सकलें यानाः, जिमिसं थन बियाच्वनागु तथ्यांकं क्यनाच्वंगु दु कि एमएफएन२या पुनः अभिव्यक्तिं तच्वःगु ओक्सफोसया कमी, तच्वःगु एमटीडीएनएया कमी, व अत्यन्त असामान्य इस्टा थें न्याःगु आकृति विज्ञान दूगु उन्नत पीएनयात पूर्ण रुपं उद्धार यायेफु, गुकिलिं उन्नत ल्वेय् नं निरन्तर प्रगति बीफु। न्युरोडिजेनेरेसनं कोषिका सी न्ह्यःया अवस्थाया लित हयेफइगु प्रमाण बी । थ्व स्तरया मेटाबोलिक लचकतायात न्युरोनया एथेरोस्क्लेरोसिस (टीसीए चक्रया छगू रिवाइरिङ) प्रेरित यायेगु क्षमतां अझ बः बी, गुकिलिं ओक्सफोस मदुगु पीएनय् पीसीएक्स अभिव्यक्तियात निरोधित याइ व कोष मृत्युयात अप्वयेकी, गुकिलिं सुरक्षात्मक भूमिका म्हिती (चित्र ५एफ)।
थ्व अध्ययनय् जिमिसं प्रमाण बिया कि ओक्सफोस डिसफंक्सनय् पीएनया प्रतिक्रिया मेटाबोलिक प्रोग्रामं सक्रिय जुइगु डिफरेन्सियल एक्टिभेसन पथया माध्यमं बुलुहुँ टिसीए साइकल एथेरोस्क्लेरोसिसय् कन्भर्ज जुइगु खः । जिमिसं यक्व पूरक विधिं प्रोटिओमिक विश्लेषणया पुष्टि याना व गम्भीर माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनं चुनौती बीबलय् न्युरोनय् न्हापा मसिउगु मेटाबोलिक इलास्टिसिटीया रुप दइगु खँ पित हया। झीगु आश्चर्यया खँ छु धाःसा, मुक्कं रिवाइरिङ प्रक्रियां न्युरोडिजेनेरेसनलिसे क्रमिक व अपरिवर्तनीय रुपं नापं वइगु टर्मिनल मेटाबोलिक अवस्थायात अनिवार्य रुपं चिं तइमखु, तर झीगु तथ्यांकं कोष मृत्यु न्ह्यःया चरणय् नं थ्व छगू मर्मत न्युरोनया गठन यायेफु धकाः सुझाव बी फंक्शनल कम्पेन्सेशन मेकानिज्म । थ्व लूनं न्युरोनय् म्हय् यक्व हे मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी दुगु संकेत बी। थ्व तथ्यं प्रमाणित याइ कि एमएफएन२ लिपा पुनःप्रवेशं मू मेटाबोलिक मार्करया अभिव्यक्तियात उल्टे यायेफु व पीएन डिजेनेरेसनयात पनेफु। उकिया पल्सा, थुकिं एथेरोस्क्लेरोसिसयात पनेगु व नसायात तीव्रता बीगु याइ । ट्रान्ससेक्सुअल।
जिमिगु अनुसन्धानय् दकलय् आकर्षक निष्कर्ष मध्ये छगू थ्व ख कि ओक्सफोस मदुगु पीएनं विशेष रुपं आर्टेरिओस्क्लेरोसिसयात उत्तेजित याइगु एन्जाइम अप-रेगुलेट याना टिसीए चक्र मेटाबोलिज्मयात परिमार्जन यायेफु। मेटाबोलिक पुनर्व्यवस्थापन क्यान्सर कोषया छगू सामान्य विशेषता ख, गुकिलिं गुलिं टिसीए चक्र इन्टरमिडिएटया पूरक ग्लुटामिनय् निर्भर जुइ गुकिलिं रिड्युसिङ इक्विभेलेन्त दयेकि, गुकिलिं श्वासप्रश्वासया श्रृंखलायात न्ह्याकी व लिपिड व न्युक्लियोटाइड बायोसिन्थेसिस प्रिकर्सरया उत्पादनयात कायम याइ (३९ , ४०)। नकतिनि जूगु छगू अध्ययनं क्यंगु दु कि अक्सफोस डिसफंक्सनया अनुभव याइगु पेरिफेरल टिस्यूइ ग्लुटामिन/ग्लुटामेट मेटाबोलिज्मया पुनःसंयोजन नं छगू प्रमुख विशेषता ख (५, ४१), गन टिसीए चक्रय् ग्लुटामिनया प्रवेशया दिशा अक्सफोस चोटया गम्भीरताया कारणं निर्भर जुइ (४१)। ). तर म्हय् न्युरोनल मेटाबोलिक प्लास्टिसिटीया छुं नं समानता व ल्वेया सन्दर्भय् थुकिया सम्भावित सान्दर्भिकताया स्पष्ट प्रमाणया अभाव दु। नकतिनि जूगु छगू इन भिट्रो अध्ययनय् प्राथमिक कर्टिकल न्युरोनं न्युरोट्रान्समिसनया निंतिं ग्लुटामेट पुलयात परिचालन याइगु क्यंगु दु, गुकिलिं मेटाबोलिक तनावया अवस्थाय् अक्सिडेटिभ मेटाबोलिज्म व एथेरोस्क्लेरोसिसयात प्रोत्साहन बी (४२)। थ्व खँ लुमंकेबहःजू कि टिसीए चक्र एन्जाइम सुक्सिनेट डिहाइड्रोजेनेजया फार्माकोलोजिकल निरोधया अन्तर्गत पाइरुभेट कार्बोक्सिलेसनं संस्कारित सेरिबेलर ग्रैन्युल न्युरोनय् अक्सालोएसिटेटया संश्लेषणयात कायम याइगु विश्वास दु (३४)। अथे जुसां थ्व संयन्त्रया मस्तिष्कया तन्तु (गन एथेरोस्क्लेरोसिस मू कथं एस्ट्रोसाइट्सय् जक सीमित जुइगु विश्वास दु) नापया शारीरिक सान्दर्भिकताया आः नं महत्त्वपूर्ण शारीरिक महत्त्व दु (४३)। थ्व अवस्थाय् झीगु तथ्यांकं क्यनि कि म्हय् अक्सफोसं क्षतिग्रस्त जूगु पीएनयात बीसीएए अपघटन व पाइरुभेट कार्बोक्सिलेसनय् हिलेछिं, गुगु टिसीए पुल इन्टरमिडिएटया पूरकया निगु मू स्रोत ख। न्युरोनल एनर्जी मेटाबोलिज्मय् बीसीएए क्याटाबोलिज्मया पुटेटिभ योगदानया प्रस्ताव तःगु दुसां न्युरोट्रान्समिसनया निंतिं ग्लुटामेट व गाबाया भूमिकाया नापं (४४) थ्व संयन्त्रया इन भिभोय् आः नं छुं प्रमाण मदुनि। अतः, थ्व अनुमान यायेत अःपु कि डिसफंक्सनल पीएनं एथेरोस्क्लेरोसिस अप्वयेकाः आत्मसात प्रक्रियां संचालित टिसीए इन्टरमिडिएटया खपतयात स्वतः क्षतिपूर्ति यायेफु। विशेष यानाः, एस्पार्टिक एसिडया अप्वःगु माग कायम यायेत पीसीएक्सया अपरेगुलेसन मालेफु, गुकियात माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सन दूगु प्रोलिफेरेटिङ सेलय् क्यनातःगु दु (४५)। अथे जुसां, झीगु मेटाबोलोमिक्स विश्लेषणं Mfn2cKO PNs (चित्र S6A) य् एस्पार्टिक एसिडया स्थिर-अवस्था स्तरय् छुं नं महत्वपूर्ण हिउपाः लुइके मफुत, गुकिं अनुमानित रुपं प्रजननशील कोष व पोस्ट-माइटोटिक न्यूरन्स दथुइ एस्पार्टिक एसिडया थीथी मेटाबोलिक उपयोगयात प्रतिबिम्बित याइ । इन भिभोय् डिसफंक्शनल न्युरोनय् पीसीएक्स अपरेगुलेसनया यथार्थ संयन्त्रया विशेषता ल्यं दनिसां जिमिसं थ्व अकाल प्रतिक्रियां न्युरोनया रेडक्स अवस्था कायम यायेत महत्त्वपूर्ण भूमिका म्हितीगु क्यना, गुकियात सेरिबेलर स्लाइसय् एफएलआईएम प्रयोगय् क्यंगु ख। विशेष यानाः, पीएनयात अप-रेगुलेट यायेगु पीसीएक्सयात पनेगु ज्यां अप्व अक्सिडाइज अवस्थाय् थ्यंकेफु व कोषया मृत्युयात तीव्रता बीफु। बीसीएए अपघटनया सक्रियता व पाइरुभेटया कार्बोक्सिलेसन माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया पेरिफेरल टिस्यूया विशेषता क्यनेगु उपाय मखु (७)। अतः, इपिं अक्सफोस-कमि दूगु न्युरोनया प्राथमिकता विशेषता खनेदु, भले थ्व छगू जक्क विशेषता मखुसां, गुगु न्युरोडिजेनेरेसनया निंतिं महत्त्वपूर्ण ख। ।
सेरिबेलर ल्वे छगू विषम प्रकारया न्युरोडिजेनेरेटिभ ल्वे ख गुकिलिं सामान्यतया एटाक्सियाया रुपय् खने दै व प्रायः पीएनयात क्षति याइ (४६)। थ्व न्युरोन जनसंख्या विशेष यानाः माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया निंतिं जोखिमय् ला छाय् धाःसा मुस्याय् इमिगु चयनात्मक अपघटन मनुया स्पाइनोसेरिबेलर एटाक्सियाया विशेषता दूगु यक्व मोटर लक्षणयात पुनःनिर्माण यायेत पर्याप्त जुइ (१६, ४७, ४८)। रिपोर्ट कथं म्युटेन्ट जीन दूगु ट्रान्सजेनिक माउस मोडेल मनुया स्पाइनोसेरिबेलर एटाक्सिया नाप स्वापू दूगु व माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सन दु (४९, ५०), गुकिलिं पीएनपीएचय् ओक्सफोसया कमीया लिच्वःया अध्ययन यायेमाःगु महत्वयात बः बियातःगु दु। अथे जूगुलिं, थुगु ज्वःमदुगु न्युरोन जनसंख्यायात प्रभावकारीकथं अलग यायेत व अध्ययन यायेत विशेषकथं उपयुक्त जुइ । अथे जुसां पीएनत दबावया प्रति तसकं संवेदनशील जुइगु व मुक्कं सेरिबेलर कोष जनसंख्याया म्हो अनुपातया हिसाब काइगुयात ध्यानय् तयाः यक्व ओमिक्सय् आधारित अध्ययनया निंतिं, इमित मुक्कं कोषया रुपय् चयनात्मक पृथक्करण यायेगु अझ नं छगू चुनौतीपूर्ण पक्ष ख। मेमेगु कोष प्रकार (विशेष यानाः वयस्क ऊतक)या प्रदूषणया निरपेक्ष अभाव प्राप्त यायेगु लगभग असम्भव जूसां जिमिसं डाउनस्ट्रिम प्रोटिओमिक्स विश्लेषणया निंतिं पर्याप्त ल्याखय् व्यवहारिक न्यूरन्स प्राप्त यायेत एफएसीएसलिसे छगू प्रभावकारी विघटन पलाः संयोजन याना, अले क्विट उच्च प्रोटिन कभरेज दु (लगभग ३००० सेट प्रोटिन कभरेज दु । (५१) पूर्ण कोषया व्यवहार्यता संरक्षण यानाः झीसं थन बियाच्वनागु विधिं माइटोकन्ड्रियाय् मेटाबोलिक मार्गय् जुइगु हिउपाःया जाँच यायेगु जक मखु, थुकिया साइटोप्लाज्मिक समकक्षय् जुइगु हिउपाःया जाँच यायेगु नं अनुमति बी, गुकिं माइटोकन्ड्रियाया झिल्ली झिल्ली लेबल संवर्धनया छ्यलाबुलायात पूरक याइ, विशिष्ट टु माइटोकन्ड्रिया tissu member in the new memberle the (५२, ५३) जिमिसं वर्णन यानागु विधि पुर्किन्जे कोषया अध्ययननाप जक्क स्वापू मदु, तर माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया मेमेगु मोडेल नापं ल्वगि मस्तिष्कय् जुइगु मेटाबोलिक हिउपायात सम्बोधन यायेत छुं नं प्रकारया कोषय् अःपुक छ्यलेछिं।
अन्तय्, जिमिसं थ्व मेटाबोलिक पुनर्व्यवस्था प्रक्रियाया झ्वलय् छगू चिकित्सीय झ्याःया पहिचान यानागु दु गुकिलिं सेलुलर तनावया मू संकेतयात पूवंक उल्टे यायेफु व न्युरोनल डिजेनेरेसनयात पनेफु। अतः, थन वर्णन यानातःगु रिवाइरिङया क्रियाशील निहितार्थ थुइकेबलय् माइटोकन्ड्रियाल डिसफंक्सनया इलय् न्युरोनल व्यवहार्यता कायम यायेगु सम्भावित उपचारया मौलिक अन्तर्दृष्टि बीफु। मेमेगु मस्तिष्क कोष प्रकारय् ऊर्जा चयापचयय् जुइगु हिउपायात विच्छेदन यायेगु उद्देश्यं भविष्यय् थ्व सिद्धान्तया मेमेगु न्यूरोलोजिकल ल्वेय् प्रयोज्यता पूवंक लुइकेत आवश्यक दु।
माइटोपार्क छुँयात न्हापा हे वर्णन यानातःगु दु (३१) । loxP फ्ल्याङ्किङ Mfn2 जीन दूगु C57BL/6N मुस्याया वर्णन न्हापा हे यानातःगु दु (१८) व L7-Cre मुस्या (२३) नापं क्रस यानातःगु दु। अनंलि लिच्वःया डबल हेट्रोजाइगस सन्तानयात होमोजाइगस Mfn2loxP/Mfn2loxP मुस्यानाप क्रस याना Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre)या निंतिं पुर्किन्जे-विशिष्ट जीन नकआउट दयेकल। संभोगया छगू उपसमूहय् थप क्रसया माध्यमं जीटी (रोसा२६) सोरस्टप-माइटो-वाईएफपी एलील (स्टप-एमटीवाईएफपी) दुथ्याकल (२०)। फुक्क पशु प्रक्रिया युरोपेली, राष्ट्रिय व संस्थागत निर्देशिका कथं याःगु खःसा जर्मनीया उत्तर राइन-वेस्टफालियाया उम्वेल्ट व भर्ब्राउचेर्सशुट्जया लान्डेसमटफरनाचुरं स्वीकृति ब्यूगु खः । पशुया ज्या नं युरोपियन फेडरेशन अफ लेबोरेटरी एनिमल साइन्सेज एसोसिएसनया निर्देशन कथं जुइ ।
प्वाथय् दुम्ह मिसाया सर्भिकल डिस्लोकेशनयात एनेस्थेसिया यायेधुंकाः छुँया भ्रूणयात अलग तइ (इ १३) । १० एमएम हेपेसया पूरक ह्यान्क्सया ब्यालेन्स साल्ट सोलुसन (एचबीएसएस)य् कर्टक्सयात विच्छेदन याना डुलबेकोया मोडिफाइड ईगलया माध्यमय् पपेन (२० यू/एमएल) व सिस्टिन (१μg/एमएल) दूगु पास याःगु ख। टिस्यूयात डिएमइएमय् इन्क्यूबेट या) अले एन्जाइमेटिक पाचनं थुकियात डिसोसिएट या । Ml) ३७°C २० मिनेटया निंतिं, व अनंलि १०% भ्रूण बोभाइन सीरमया पूरक DMEM य् यान्त्रिक रुपं मिल याइ। इमेजिङ विश्लेषणया निंतिं ६ सेमि कल्चर डिसय् २×१०६ घनत्वय् वा ०.५×१०५ सेल/सेमी२ घनत्वय् पोलिलिसिनं लेपित ग्लास कभरस्लिपय् कोषयात सीड याःगु खः । ४ घौ लिपा थ्व माध्यमया थासय् १% बी२७ सप्लिमेन्ट व ०.५ एमएम ग्लुटाम्याक्स दूगु न्युरोबेसल सीरम मुक्त माध्यम तःगु ख। अनंलि न्युरोनयात प्रयोगया दथुइ ३७°C व ५% CO2य् तया तःगु ख, व वालय् छक्वः नकेगु या। इन भिट्रोय् पुनर्संयोजनयात प्रेरित यायेत निन्हुगु दिं इन भिट्रोय् न्युरोनया वासः यायेत क्वय् बियातःगु AAV9 भाइरस भेक्टोरया ३μl (२४-वेल कल्चर डिस) वा ०.५μl (२४-वेल प्लेट) छ्यःगु ख: AAV9.CMV.PI.eGFP। डब्लुपीआरई.बीजीएच (एडजेन, क्याटलग ल्याः १०५५३०-एएभी९) व एएभी९.सीएमभी.एचआई.ईजीएफपी-क्रे.डब्लुपीआरई.एसभी४० (एडजेन, क्याटलग ल्याः १०५५४५-एएभी९) ।
माउस Mfn1 व Mfn2 कम्प्लीमेन्टरी डीएनए (क्रमशः एडजेन प्लाज्मिड #२३२१२ व #२३२१३ं प्राप्त) सी-टर्मिनसय् V5 सिक्वन्स (GKPIPNPLLGLDST) नापं चिं तयातःगु दु, व T2A सिक्वन्सया माध्यमं फ्रेमय् mCherry नाप फ्युज यानातःगु दु। Grx1-roGFP2 हाइडेलबर्ग टिपी डिक डीएफकेजेड (ड्यूचेस क्रेब्सफोर्ससुङसेन्ट्रम) या उपहार खः । पारम्परिक क्लोनिंग विधि छ्यला tdTomato क्यासेट हिलाः क्यासेटयात pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ब्याकबोन (एडजेन रेफरेन्स नम्बर २८३०६)य् सबक्लोन यानाः pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV2-VCA5, फ्लेक्स-एमचेरी-टी२ए-एमएफएन१-भि५ व पीएएभी-सीएजी-फ्लेक्स-जीआरएक्स-आरओजीएफपी२ वेक्टर। नियन्त्रण वेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry दयेकेगु निंतिं नं अज्याःगु हे रणनीति छ्यःगु खः । एएभी-एसएचपीसीएक्स कन्स्ट्रक्ट दयेकेगु निंतिं छगू प्लाज्मिड एएभी भेक्टोर (भेक्टरबिल्डर, पीएएभी [एसएचआरएनए] -सीएमभी-एमचेरी-यू६-एमपीसीएक्स- [एसएचआरएनए # १]) माः, गुकिलि एसएचआरएनए लक्षित माउस पीसीएक्स (५′जीटीएजीटीटीटीटीजीसीसीटीएसीटी)यात एन्कोड याइगु डीएनए अनुक्रम दइ। ३′) यु६ प्रोमोटरया नियन्त्रणय् एमचेरीयात सीएमभी प्रोमोटरया नियन्त्रणय् छ्यलिगु या। सहायक एएभि भेक्टोरया उत्पादन उत्पादकया निर्देशन कथं याःगु खः (सेल बायोल्याब्स) । संक्षेपय्, एमचेरी-टि२ए-एमएफएन२-भि५ (पिएएभि-सिएजि-फ्लेक्स-एमचेरी-टि२ए-एमएफएन२-भि५), एमचेरी-टि२ए-एमएफएन१-भि५ (पिएएभि-सिएजि-फ्लेक्स-एमचेरी) क्षणिक रुपं सेलएमएफएभि२९ या ट्रान्सफेक्सन), २९ या ट्रान्सफेक्सन दुगु ट्रान्सफर प्लाज्मिड छ्यलादिसँ । (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) वा Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीन, नापं एएभी१ क्याप्सिड प्रोटिन व एक्सेसरी प्रोटिन कोडिंग प्याकेजिङ प्लाज्मिड प्लाज्मिड, क्याल्सियम फस्फेट विधि छ्यला। कच्चा भाइरस सुपरनेतेन्तयात सुख्खा आइस/इथेनॉल बाथय् फ्रिज-थव साइकल व फस्फेट बफर सेलाइन (पीबीएस)य् लाइज सेल याना प्राप्त याःगु ख। एएभी भेक्टोरयात डिस्कन्टिन्युअस आयोडिक्सानोल ग्रेडिएन्त अल्ट्रासेन्ट्रिफ्युगेसन (२४ घण्टा ३२,००० आरपीएम व ४° सेल्सियसय्) शुद्ध याना एमिकोन अल्ट्रा-१५ सेन्ट्रिफ्युगल फिल्टर छ्यला केन्द्रित याःगु ख। एएभी१-सीएजी-फ्लेक्स-एमचेरी-टी२ए-एमएफएन२-भी५ [२.९×१०१३ जीनोम प्रतिलिपि (जीसी)/एमएल], एएभी१-सीएजी-फ्लेक्स-एमचेरी (६.१×१०१२ जीसी/एमएल), एएभी१-सीएजी-फ्लेक्सया जीनोम टाइटर न्हापाया कथं डिसुरेटिभ बाइपीसीआरडी४) जूगु खः । (क्यूपीसीआर) -एमएफएन१-भी५ (१.९×१०१३ जीसी/एमएल) व एएभी१-सीएजी-फ्लेक्स-जीआरएक्स-आरओजीएफपी२ (८.९×१०१२ जीसी/एमएल)।
प्राथमिक न्युरोनयात आइस-कोल्ड १x पीबीएसय् स्क्राप अफ याना पेलेट याना ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० / ०.५% सोडियम डिओक्सिकोलेट/पीबीएस लाइसिस बफरय् फस्फेटेज व प्रोटिज इन्हिबितर (रोचे) दूगु होमोजेनाइज यानातःगु ख। बाइसिन्कोनिनिक एसिड परीक्षण (थर्मो फिसर साइन्टिफिक) छ्यलाः प्रोटिनया परिमाणन याःगु खः । अनंलि प्रोटिनयात एसडीएस-पोलियाक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसं अलग याःगु ख, व अनंलि पोलिभिनाइलाइडिन फ्लोराइड मेम्ब्रेन (जीई हेल्थकेयर)य् ब्लट यानातःगु ख। गैर-विशिष्ट थाय् ब्लक यानाः प्राथमिक एन्टिबडी (विवरणया निंतिं तालिका S1 स्वयादिसँ) ५% दुरुइ टिबीएसटी (ट्वीनलिसे ट्रिस-बफर सेलाइन), वाशिंग स्टेप व टिबीएसटी इन्क्युबेटय् सेकेन्डरी एन्टिबडी नापं इन्क्युबेट यायेगु। +४°C स प्राथमिक एन्टिबडीलिसे चान्हय् इन्क्यूबेट या । सिलेधुंकाः, कोथाया तापक्रमय् २ घौतक सेकेन्डरी एन्टिबडी ति । वयां लिपा व हे ब्लटयात एन्टि-β-एक्टिन एन्टिबडीलिसे इन्क्युबेट यानाः व हे लोडिङया पुष्टि याःगु खः । केमिलुमिनेसेन्सय् हिलाः व केमिलुमिनेसेन्सयात अप्वयेकाः पत्ता लगे यायेगु (जिइ हेल्थकेयर) ।
न्हापा ग्लास कभरस्लिपय् सीड यानातःगु न्युरोनयात ४% प्याराफर्मलडिहाइड (पीएफए)/पीबीएसं निर्दिष्ट ई बिन्दुइ कोथाया तापक्रमय् १० मिनेटया निंतिं फिक्स यानातःगु खः । कभरस्लिपय् न्हापां ०.१% ट्राइटन एक्स-१००/पीबीएस ५ मिनेटया निंतिं कोथाया तापक्रमय्, व लिपा ब्लकिङ बफर [३% बोभाइन सेरम एल्बुमिन (बीएसए)/पीबीएस]य् पारित याइ। निन्हुगु दिं कभरस्लिपयात ब्लकिङ बफरं हिला उपयुक्त फ्लोरोफोर-कन्जुगेटेड सेकेन्डरी एन्टिबडी नापं २ घण्टा कोथाया तापक्रमय् इन्क्युबेट यानातःगु ख; अन्तय्, नमूनायात ४′,६-डायमिडिनो-२ -फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) काउन्टरस्टेन यानाः पीबीएसय् बांलाक्क धुनाः एक्वा-पोलि/माउन्टं माइक्रोस्कोप स्लाइडय् फिक्स यानातःगु खः ।
मुस्या (मिजं व मिसा) केटामिन (१३० एमजी/किलो) व जाइलाजिन (१० एमजी/किलो)या इन्ट्रापेरिटोनियल इन्जेक्सनं एनेस्थेसिया यानाः कार्प्रोफेन एनाल्जेसिक (५ एमजी/किलो) , व स्टीरियोटेक्टिक उपकरण (Kopd a warmf) नापं सबक्युटेनियस कथं प्रशासित याःगु खः । खोपडीयात उजागर यानाः डेन्टल ड्रिल छ्यला मिस हड्डी नाप स्वापू दूगु सेरिबेलर कर्टक्सया भागयात पातला यानादिसँ (ल्याम्ब्दा: टेल १.८, लेटरल १, लोबुल IV व V नाप स्वापू दूगु)। क्वय् च्वंगु भस्कुलरयात स्यंकेगुपाखें बचे जुइत खप्परय् होशियारीपूर्वक चिकिचाधंगु प्वाल दयेकेगु निंतिं घुमावदार सिरिन्जया सुइ छ्यलादिसँ । अनंलि थिन ड्र ग्लास क्यापिलारीयात माइक्रो-होलय् (डुरा मेटरया भेन्ट्रल साइडय् -१.३ निसें -१ तक्क) बुलुहुँ दुछ्वइ, व २०० निसें ३०० एनएल एएभी माइक्रो-इन्जेक्टरय् (नारिशिगे) म्यानुअल सिरिन्ज (नारिशिगे) सेभर टाइम१० निसें सेभरया अवधिइ इन्जेक्सन याइ। मिनेटया झ्याः । इन्फ्युजन यायेधुंकाः भाइरस पूवंक न्यनावनेत क्यापिलारीयात मेगु १० मिनेट तयेमाः । क्यापिलारी लिकायेधुंका घाःया स्याइगु म्हो यायेत व पशुयात वासः यायेत छ्यंगुलिइ बांलाक सिलेगु याइ। अपरेशन लिपा छुं दिं तक पशुतय्त एनाल्जेसिक (क्यास्पोफेन) वासः बियाः वासः याःगु खः, गुगु इलय् उमिगु शारीरिक अवस्थाया बांलाक अनुगमन याःगु खःसा अनंलि उमित निर्धारित ईलय् इउथानाइज याःगु खः । फुक्क प्रक्रिया युरोपेली, राष्ट्रिय व संस्थागत निर्देशिका कथं याःगु खःसा जर्मनीया उत्तर राइन–वेस्टफालियाया उम्वेल्ट व भर्ब्राउचेर्सशुट्जया लान्डेसमटफरनाचुरं स्वीकृति ब्यूगु खः ।
जनावरतेत केटामिन (१०० एमजी/केजी) व जाइलाजिन (१० एमजी/केजी) तया एनेस्थेसिया बिया, व न्हापां नुगःचुइ ०.१ एम पीबीएस तया, व लिपा पीबीएसय् ४% पीएफए ​​तया पर्फ्युज यात। टिस्यूयात विच्छेदन यानाः ४% पिएफए/पिबिएसय् ४ डिग्री सेल्सियसय् चान्हय् तयातल । पीबीएसय् निश्चित मस्तिष्कं साजिटल सेक्सन (५० माइक्रोमिटर तःग्वःगु) तयार यायेत भ्वाइब्रेटिङ चाकु (लाइका माइक्रोसिस्टम्स जिएमबीएच, भियना, अस्ट्रिया) छ्यःगु खः । मेगु कथं निर्दिष्ट मजूतले, स्वतन्त्र-फ्लोटिङ खण्डया दाग क्वथाया तापक्रम व हिलाबुलाय् च्वय् वर्णन यानातःकथं (१३) याःगु ख। संक्षेपय् धायेगु खःसा न्हापां प्राप्त स्लाइसयात ०.५% ट्राइटन एक्स-१००/पीबीएसं १५ मिनेटया निंतिं कोथाया तापक्रमय् पारगम्यता बिउगु खः; छुं एपिटोप (Pcx व Shmt2)या निंतिं, ८०°C (PH ९)य् ट्रिस-EDTA बफरय् थ्व चरणया पलेसा २५ मिनेटया निंतिं स्लाइसयात क्वकायेगु याइ। थ्व धुंका, खण्डतेत प्राथमिक एन्टिबडी (तालिका S1 स्वयादिसँ) नापं ब्लकिङ बफर (३% BSA/PBS)य् ४°Cय् चान्हय् हिलाबुला याना इन्क्युबेट यानातःगु ख। कन्हय् कुन्हु, खण्डयात ब्लकिङ बफरं हिला उपयुक्त फ्लोरोफोर-कन्जुगेटेड सेकेन्डरी एन्टिबडी नापं २ घण्टा कोथाया तापक्रमय् इन्क्युबेट यानातःगु ख; अन्तय्, खण्डतेत पीबीएसय् बांलाक्क धुना, डीएपीआईं काउन्टर-स्टेन याना, व अनंलि एक्वापोलिमाउन्त माइक्रोस्कोप स्लाइडय् फिक्स याना।
नमूनायात इमेज यायेत ह्याउँगु प्रकाश लेजर व ४०५ डायोड अल्ट्राभायोलेट लेजर तयातःगु लेजर स्क्यानिङ कन्फोकल माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी८-एक्स वा टीसीएस डिजिटल लाइट शीट, लाइका माइक्रोसिस्टम) छ्यःगु खः । फ्लोरोफोरयात उत्तेजित यानाः व हाइब्रिड डिटेक्टर (HyDs) नापं संकेत संकलन यानाः, LAS-X सफ्टवेयर छ्यला क्रमिक मोडय् न्यक्विस्ट नमूनाया अनुरुप स्ट्याक यानातःगु किपा संकलन याःगु खः: गैर-मात्रात्मक प्यानलया निंतिं, थ्व अत्यधिक गतिशील संकेत (दसु, सोमेटिक सेल व डेन्ड्राइट्सय् UN dect in PFPse) mt ब्राइटआर मोड)। पृष्ठभूमि म्ह्व यायेत ०.३ निसें ६ एनएसया गेटिङ छ्यली ।
ल्ययातःगु कोषिकाया धात्थेंगु ईया इमेजिङ्ग । १% बी२७ पूरक व ०.५ एमएम ग्लुटाम्याक्स दूगु न्यूरोबेसल-ए माध्यमय् क्रमबद्ध यायेधुंकाः कोषयात तुरुन्त हे पोलि-एल-लाइसिन-लेपित ग्लास स्लाइडय् सीड याःगु खः (μ-स्लाइड८ वेल, इबिडी, क्याटलग ल्याः ८०८२६) , अले अनंलि थुकियात a% CO2 to the17s य् तयेगु । बसोबास यायेत । रियल टाइम इमेजिङ लाइका एसपी ८ लेजर स्क्यानिङ कन्फोकल माइक्रोस्कोपय् ह्याउँगु लेजर, HyD, ६३×[१.४ न्युमेरिकल एपर्चर (NA)] चिकंया वस्तुगत लेन्स व हिटिङ स्टेजं सुसज्जित याःगु ख।
माउसयात याकनं हे कार्बन डाइअक्साइडं एनेस्थेसिया बियाः छ्यं क्वछुकल, मस्तिष्कयात याकनं हे खोपडीं लिकयाबिल, अले २००μm तःधिकः (१३C लेबलिङ प्रयोगया निंतिं) वा २७५μm तःधिकः (निगू फोतोन प्रयोगया निंतिं) साजिटल सेक्सनय् क्वय् बियातःगु creceam सामग्रीं भरे यानाः The VH-i6M । वैज्ञानिक, वालडोर्फ, जर्मनी) क्वय् बियातःगु पदार्थं जाःगु दु : १२५ एमएम हिम-चिकुगु, कार्बन-संतृप्त (९५% O2 व ५% CO2) कम Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (ACHCSF) NaCl, २.५ एमएम KCl, १.२५ एमएम बफर m3O, Na50. ग्लुकोज, ०.५ एमएम CaCl2 व ३.५ एमएम MgCl2 (३१० निसें ३३० एमएमओएलया ओस्मोटिक प्रेशर)। प्राप्त ब्रेन स्लाइसयात प्रि-इन्क्यूबेशन च्याम्बरय् स्थानान्तरण यानादिसँ गुकी अप्वः Ca2 + ACSF (१२५.० एमएम NaCl, २.५ एमएम KCl, १.२५ एमएम सोडियम फस्फेट बफर, २५.० एमएम NaHCO3, २५.० एमएम d-ग्लुकोज. एमजीसीएल२) मध्यम) पीएच ७.४ व ३१० निसें ३२० एमएमओएल)।
इमेजिङ प्रक्रियाया झ्वलय् स्लाइसयात छगू समर्पित इमेजिङ रुमय् यंकल, व थ्व प्रयोग ३२° निसें ३३° सेल्सियसया स्थिर तापक्रमय् निरन्तर एसीएसएफ पर्फ्युजनया अन्तर्गत याःगु ख। स्लाइस इमेजिङया निंतिं लाइका २५x वस्तुगत लेन्स (एनए ०.९५, लः), टि: नीलम लेजर (गिरगिट भिजन II, कोहेरेन्ट) तयातःगु मल्टिफोटन लेजर स्क्यानिङ माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी८ एमपी-ओपीओ, लाइका माइक्रोसिस्टम्स) छ्यःगु खः । एफएलआईएम मोड्यूल (पिकोहार्प३००, पिकोक्वान्ट)।
जिआरएक्स१-आरओजिएफपि२ या एफएलआइएम । पीएनया साइटोप्लाज्मिक रेडक्स अवस्थाय् जुइगु हिउपाःयात साजिटल ब्रेन स्लाइसय् निगु फोतोन एफएलआईएमं मापन याःगु ख, गन Grx1-roGFP2 बायोसेन्सरं पीएनयात लक्षित याःगु ख। पीएन तहलय् अधिग्रहण क्षेत्रयात स्लाइस सतह स्वया करिब ५० निसें ८० μm क्वय् ल्यइ गुकिलिं छगू व्यवहारिक पीएन (अर्थात डेन्ड्राइट्सया नापं बिडेड स्ट्रक्चरया अभाव वा न्यूरोनल मोर्फोलोजिकल हिउपाः) व डबल पोजिटिभ roGFP2 सेन्सर व AAVxe encoding sh. एमचेरी)। २x डिजिटल जूम [उत्तेजना तरङ्ग दैर्ध्य: ८९० एनएम; ५१२ एनएम ५१२ पिक्सेल]। पत्ता लगे यायेगु : आन्तरिक HyD, फ्लोरोसेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC) फिल्टर ग्रुप] व २ निसें ३ मिनेटया दुने इमेज एभरेजिङया छ्येला कर्भ फिटिङया निंतिं पर्याप्त फोतोन (कुल १००० फोतोन) संकलन जुइगु सुनिश्चित याइ। Grx1-roGFP2 जाँचया संवेदनशीलता व FLIM अवस्थाया प्रमाणिकरण roGFP2 या जीवनकाल मूल्यया अनुगमन यानाः पर्फ्युजन ACSF (अक्सिडेसनयात अधिकतम यायेत, गुकिया लिच्वः कथं जीवनकाल अप्वइ), व अनंलि diminimizotol of कमी, गुकिया लिच्वः कथं आयु म्हो जुइ) (चित्र S8, D to G)। प्राप्त परिणामया विश्लेषण यायेत FLIMfit 5.1.1 सफ्टवेयर छ्यलादिसँ, मापन यानातःगु आईआरएफ (इन्स्ट्रुमेन्ट रेस्पोन्स फंक्शन) य् मुक्कं छविया एकल एक्सपोनेन्सियल डिके कर्भ फिट यानादिसँ, अले χ२ लगभग १ खः । परिमाणनया निंतिं छ्यली ।
माइटोकन्ड्रियाल सम्भावना विश्लेषण। तीव्र खण्डयात ३० मिनेटया निंतिं पर्फ्युज्ड एसीएसएफय् प्रत्यक्ष रुपं १०० एनएम टिएमआरएम तना इन्क्युबेट यायेधुंका पीएनया माइटोकन्ड्रियाल पोटेंशियल हिउपायात निगु फोतोन माइक्रोस्कोपं मापन याःगु ख। टिएमआरएम इमेजिङ ९२० एनएमय् प्रोबयात उत्तेजित याना व आन्तरिक हाइडी (टेट्रामेथाइलरोडामिन आइसोथियोसाइनेट: ५८५/४० एनएम) छ्येला संकेत संकलन याना याःगु ख; व हे उत्तेजना तरङ्ग दैर्ध्य छ्यला तर mtYFP इमेज यायेत फरक आन्तरिक HyD (FITC :525/50) छ्यला। छगू कोष स्तरय् माइटोकन्ड्रियाल सम्भावना मूल्यांकन यायेत इमेजजेया इमेज क्यालकुलेटर प्लग-इन छ्यलादिसँ । संक्षेपय् धायेगु खःसा प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = min (mtYFP, TMRM) छ्यला माइटोकन्ड्रियाल क्षेत्रयात म्हसीकेगु याइ गुकिलिं पुर्किन्जे सोमालीइ टिएमआरएम सिग्नलयात स्वापू दूगु च्यानलया सिंगल-स्ट्याक कन्फोकल इमेजय् क्यनि। अनंलि लिच्वःया मास्कय् पिक्सेल क्षेत्रया परिमाणन याइ, व अनंलि mtYFP च्यानलया सम्बन्धित थ्रेसहोल्ड सिंगल-स्ट्याक इमेजय् सामान्यीकरण याना माइटोकन्ड्रियाल पोतेन्सियल क्यनिगु माइटोकन्ड्रियाल फ्राक्सन प्राप्त याइ।
ह्युजेन्स प्रो (साइन्टिफिक भल्युम इमेजिङ्ग) सफ्टवेयरं किपायात डिकन्भोलुट याःगु खः । टाइलया स्क्यान यानातःगु किपाया निंतिं लास–एक्स सफ्टवेयरं बियातःगु अटोमेटिक स्टिचिङ एल्गोरिदम छ्यला छगू हे टाइलया मन्टेज याइ । इमेज क्यालिब्रेशन लिपा इमेजजे व एडोब फोटोशप छ्यला इमेजयात अझ प्रोसेस यानाः ब्राइटनेस व कन्ट्रास्टयात छगू हे कथं समायोजन यायेफइ । ग्राफिक तयार यायेत एडोब इलस्ट्रेटर छ्य ।
एमटिडिएनए फोकस विश्लेषण । कन्फोकल माइक्रोस्कोपं डीएनए विरुद्ध एन्टिबडी लेबल यानातःगु सेरिबेलर सेक्सनय् एमटीडीएनएया घाःया ल्याः मापन याःगु खः । प्रत्येक कोषया म्ह व प्रत्येक कोषया न्यूक्लियसया निंतिं प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र दयेका मल्टि मेजर प्लग-इन (इमेजजे सफ्टवेयर) छ्यला सम्बन्धित क्षेत्रया गणना याःगु ख। साइटोप्लाज्मिक लागा कायेत कोषिका म्ह लागाया आणविक लागा घटा या । अन्तय्, एनालाइज पार्टिकल्स प्लग-इन (इमेजजे सफ्टवेयर) छ्यला थ्रेसहोल्ड इमेजय् एमटीडीएनए क्यनिगु साइटोप्लाज्मिक डीएनए प्वाइन्टयात स्वतः परिमाणित याःगु ख, व प्राप्त लिच्वःयात सीटीआरएल मुस्याया पीएन औसतय् सामान्यीकरण याःगु ख। लिच्वःयात छगू कोषिकाय् न्यूक्लियोसाइडया औसत ल्याःकथं क्यनी ।
प्रोटिन अभिव्यक्ति विश्लेषण। छगू कोष स्तरय् पिएनय् प्रोटिन अभिव्यक्तिया मूल्यांकन यायेत इमेजजेया इमेज क्यालकुलेटर प्लग-इन छ्यलादिसँ । संक्षेपय्, सम्बन्धित च्यानलया एकल-तह कन्फोकल इमेजय्, समीकरणया माध्यमं: सिग्नल = min (mtYFP, एन्टिबडी), पुर्किनाय् छगू निश्चित एन्टिबडीइ इम्युनोरिएक्टिभिटी क्यनिगु माइटोकन्ड्रियाल क्षेत्रया पहिचान याइ। अनंलि लिच्वःया मास्कय् पिक्सेल क्षेत्रया परिमाणन याइ, व अनंलि mtYFP च्यानलया सम्बन्धित थ्रेसहोल्ड सिंगल-स्ट्याक इमेजय् सामान्यीकरण याना प्रदर्शित प्रोटिनया माइटोकन्ड्रियाल फ्राक्सन प्राप्त याइ।
पुर्किन्जे कोष घनत्व विश्लेषण। इमेजजेया सेल काउन्टर प्लग-इनया छ्यलाबुला यानाः ल्याःखाःगु पुर्किन्जे कोषया ल्याःयात ल्याःखाःगु सेरिबेलर रिंगया लम्बाईं भाग यानाः पुर्किन्जे डेन्सिटीया मूल्यांकन याःगु खः ।
नमूना दयेकेगु व मुंकेगु । नियन्त्रण समूह व Mfn2cKO मुस्याया मस्तिष्कयात ०.१ एम फस्फेट बफर (पीबी)य् २% पीएफए/२.५% ग्लुटारएल्डेहाइडय् फिक्स यानातःगु ख, व अनंलि सिलिएट्स (लाइका माइक्रोसिस्टम जिएमबीएच, भियना, अस्ट्रियाय्) छ्यला कोरोनल सेक्सन तयार याःगु ख (थिकनेस ५० निसें द पीबी१ य् μm१) छ्यला कोरोनल सेक्सन तयार याःगु ख। टेट्राअक्साइड व १.५% पोटासियम फेरोसाइनाइड १ घौतक क्वथाया तापक्रमय् तयेगु । थ्व खण्डयात डिस्टिल्ड लःया स्वक: हिला, व लिपा १% युरेनिल एसिटेट दूगु ७०% इथेनॉलं २० मिनेट तक्क दाग तःगु ख। अनंलि थ्व खण्डयात ग्रेडेड अल्कोहलय् डिहाइड्रेट याना डुर्कुपान एसीएम (अराल्डाइट कास्टिङ रेजिन एम) इपोक्सी रेजिन (इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी साइन्सेज, क्याटलग नम्बर १४०४०)य् सिलिकन-लेपित ग्लास स्लाइडया दथुइ एम्बेड यानातःगु ख, व अन्तय् ६०°Cय् होभनय् पोलिमराइज याःगु ख। सेरिबेलर कर्टक्स क्षेत्र ल्ययाः लाइका अल्ट्राकट (लाइका माइक्रोसिस्टम जिएमबीएच, भियना, अस्ट्रिया)य् ५० एनएम अल्ट्राथिन सेक्सन चीकाः पोलिस्टाइरिन फिल्मं लेपित २×१ मिमी कपर स्लिट ग्रिडय् पिकयाबिल । थ्व खण्डयात १० मिनेटया निंतिं एचटुओय् ४% युरेनिल एसिटेटया द्रावणं दाग तया एचटुओय् यक्व पटक धुना, अनंलि एचटुओय् रेनोल्ड्स लीड साइट्रेटं १० मिनेट तक्क धुना, व लिपा एचटुओय् यक्व पटक धुनाबिल। माइक्रोग्राफ ट्रान्समिसन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप फिलिप्स सीएम१०० (थर्मो फिसर साइन्टिफिक, वाल्थम, एमए, अमेरिका) छ्यला टिभीआईपीएस (टिट्ज भिडियो व इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम) टेमक्याम-एफ४१६ डिजिटल क्यामरा (टिभीआईपीएस जिएमबीएच, गौटिङ, अमेरिका) छ्यला काःगु खः । जर्मनी)।
एएभी संक्रमित मुस्याया निंतिं मस्तिष्कयात अलग यानाः १ मिमी तःग्वःगु साजिटल सेक्सनय् टुक्रा यानाः फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोप छ्यला एएभी संक्रमित रिंग (अर्थात एमचेरी एक्सप्रेसिङ)या पहिचान यायेत सेरिबेलमयात जाँच याःगु खः । एएभी इन्जेक्सनया लिच्वः कथं कम्ती नं निगु लगातार सेरिबेलर रिंगय् पुर्किन्जे सेल लेयर (अर्थात लगभग मुक्कं लेयर)या तसकं अप्व ट्रान्सडक्सन दक्षता दइगु प्रयोग जक्क छ्येलिगु या। एएभी-ट्रान्सड्युस्ड लूपयात ओभरनाइट पोस्ट-फिक्सेशन (०.१ एम कोकोट बफरय् ४% पीएफए ​​व २.५% ग्लुटारएल्डेहाइड)या निंतिं माइक्रोडिसेक्ट यानाः थप प्रशोधन याःगु खः । इपोन एम्बेडिंगया निंतिं फिक्स्ड टिस्यूयात ०.१ एम सोडियम कोकोट बफर (एप्लिकेम) नापं धुना, व २% OsO4 (os, साइन्स सर्भिसेज; Caco) नाप ०.१ एम सोडियम कोकोट बफर (एप्लिकेम) ४ घण्टा इन्क्युबेट याना २ घण्टा धुना। ०.१ एम कोकामाइड बफर नापं स्वक: दोहरे या । वयां लिपा इथेनॉलया आरोही श्रृंखला छ्यला प्रत्येक इथेनॉलया द्रावणयात ४° सेल्सियसय् १५ मिनेट तक्क इन्क्युबेट याना टिश्यूयात डिहाइड्रेट याःगु ख। थ्व टिस्यूयात प्रोपिलिन अक्साइडय् स्थानान्तरण याना ४° ​​सेल्सियसय् इपोन (सिग्मा-एल्ड्रिच)य् चान्हय् इन्क्युबेट यानातःगु ख। टिस्यूयात २ घौतक कोथाया तापक्रमय् ताजा इपोनय् तयादिसँ, अले ६२ डिग्री सेल्सियसय् ७२ घौतक एम्बेड यानादिसँ । अल्ट्रामाइक्रोटोम (लाइका माइक्रोसिस्टम्स, UC6) व डायमण्ड चाकु (डायटोम, बिएल, स्वीट्जरल्याण्ड) छ्यला ७० एनएम अल्ट्राथिन सेक्सन चीकेगु, व १.५% युरेनिल एसिटेटं १५ मिनेट ३७°Cय् दाग तयेगु, व लीड साइट्रेट द्रावण ४ मिनेटया निंतिं दाग तयेगु। क्यामरा वनभ्यू ४के १६ बिट (गटन) व डिजिटलमाइक्रोग्राफ सफ्टवेयर (गटन) दुगु जेईएम–२१०० प्लस ट्रान्समिसन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (जेओएल) छ्यला इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफ काःगु खः । विश्लेषणया निंतिं, इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफ ५०००× बाय् १०,०००× डिजिटल जूमं काःगु खः ।
माइटोकन्ड्रियाया मोर्फोलोजिकल विश्लेषण । सकल विश्लेषणया निंतिं इमेजजे सफ्टवेयर छ्यला डिजिटल इमेजय् व्यक्तिगत माइटोकन्ड्रियाया कन्ट्रोल म्यानुअली आउटलाइन यानातःगु ख। थी थी मोर्फोलोजिकल प्यारामिटरया विश्लेषण याइ । माइटोकन्ड्रियाया घनत्वयात प्रत्येक कोषया कुल माइटोकन्ड्रियाल क्षेत्रफलयात साइटोप्लाज्म क्षेत्रफल (साइटोप्लाज्म क्षेत्रफल = कोष क्षेत्रफल-कोष न्यूक्लियस क्षेत्रफल) × १०० य् भाग यानाः प्राप्त जुइगु प्रतिशतया रुपय् व्यक्त याइ।माइटोकन्ड्रियाया गोलाकारता [4π∙2(area)/perimeter] सूत्रं गणना याइ। माइटोकन्ड्रियाया इस्ता मोर्फोलोजीया विश्लेषण याना मू आकार कथं निगु श्रेणीइ (“ट्युबुलर” व “ब्लिस्टर”) बायातःगु ख।
अटोफेगोसोम/लाइसोसोम ल्याः व घनत्व विश्लेषण । डिजिटल इमेजय् प्रत्येक अटोफेगोसोम/लाइसोसोमया कन्ट्रोलयात म्यानुअली आउटलाइन यायेत इमेजजे सफ्टवेयर छ्यलादिसँ । अटोफेगोसोम/लाइसोसोम क्षेत्रफलयात प्रत्येक कोषया कुल अटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचना क्षेत्रफलयात साइटोप्लाज्म क्षेत्रफल (साइटोप्लाज्म क्षेत्रफल=कोष क्षेत्रफल-न्युक्लियस क्षेत्रफल)×१०० य् भाग याना गणना याइगु प्रतिशतया रुपय् व्यक्त याइ। अटोफेगोसोम/लाइसोसोमया घनत्वया गणना कुल ल्याखं प्रति कोषय् अटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचनाया ल्याखं (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रफलया ल्याखं) (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रफल = कोष क्षेत्रफल-आणविक क्षेत्रफल) भाग याना याइ।
तीव्र सेक्सनिंग व नमूना तयारीया निंतिं लेबलिङ्ग । ग्लुकोज लेबलिङ माःगु प्रयोगया निंतिं तीव्र मस्तिष्कया स्लाइसयात प्रि-इन्क्युबेशन च्याम्बरय् स्थानान्तरण यायेमाः, गुकिलि संतृप्त कार्बन (९५% O2 व ५% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM बफर m2O, Na30) दइ। २५.० एमएम डी-ग्लुकोज, १.० एमएम CaCl २ व २.० एमएम MgCl २, pH ७.४ व ३१० निसें ३२० mOsm तक्क समायोजित), गुकिलि ग्लुकोज १३ C ६- ग्लुकोज प्रतिस्थापन (युरिसोटप, क्याटलग नम्बर CLM3-) ख। पाइरुभेट लेबलिङ माःगु प्रयोगया निंतिं तीव्र मस्तिष्कया स्लाइसयात उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० एमएम NaCl, २.५ एमएम KCl, १.२५ एमएम सोडियम फस्फेट बफर, २५.० एमएम NaHCO3, २५.० एमएम d.C.0m Ca0m व १२५m d-ग्लुकोज)य् स्थानान्तरण या। MgCl2, pH ७.४ व ३१० निसें ३२०mOsm तक समायोजन यानादिसँ), व १mM १-[१-१३C]पाइरुभेट (युरिसोटप, क्याटलग नम्बर CLM-१०८२) तयादिसँ। ३७ डिग्री सेल्सियसय् ९० मिनेटया निंतिं ब्वयात इन्क्यूबेट या । प्रयोगया अन्तय् खण्डयात याकनं ७५ एमएम एमोनियम कार्बोनेट दूगु जलीय द्रावण (pH ७.४)ं हिला ४०:४०:२० (v:v:v) एसिटोनाइट्रिल (ACN): मेथनोल: लःइ होमोजेनाइज यानातःगु ख। खण्डयात ३० मिनेटया निंतिं च्वापुइ इन्क्युबेट यायेधुंका नमूनायात २१,००० ग्रामय् १० मिनेटया निंतिं ४° सेल्सियसय् सेन्ट्रिफ्युज यानाः क्लियर सुपरनेतेन्तयात स्पीडभ्याक कन्सेन्ट्रेटरय् सुकाबिल। लिच्वःया गंगु मेटाबोलाइट पेलेटयात विश्लेषण मजूतले -८०°Cय् भण्डारण यानातःगु खः ।
१३ गू सि-लेबल यानातःगु एमिनो एसिडया लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण । तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) विश्लेषणया निंतिं मेटाबोलाइट पेलेटयात ७५μl एलसी-एमएस ग्रेडया लः (हनीवेल)य् पुनःसस्पेन्ड यानातःगु ख। ४°Cय् ५ मिनेटया निंतिं २१,००० g य् सेन्ट्रिफ्युगेसन यायेधुंका २० μl क्लिरिफाइड सुपरनेतेन्त एमिनो एसिड फ्लक्स विश्लेषणया निंतिं छ्येलिगु या धाःसा ल्यं दुगु अर्कयात तुरुन्त हे एनआयन विश्लेषणया निंतिं छ्येलिगु या (क्वय् स्वयादिसँ)। एमिनो एसिड विश्लेषण न्हापा वर्णन यानातःगु बेन्जोइल क्लोराइड डेरिभेटाइजेसन प्रोटोकल (५५, ५६) छ्यला याःगु ख। न्हापांगु चरणय् २०μl मेटाबोलाइट अर्कय् १०μl १०० एमएम सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) तया, व लिपा १०μl २% बेन्जोइल क्लोराइड (सिग्मा-एल्ड्रिच) एलसी ग्रेड एसीएनय् तया। नमूनायात संक्षिप्त रुपं भर्टेक्स यानाः २१,००० ग्रामय् २०° सेल्सियसय् ५ मिनेटया निंतिं सेन्ट्रिफ्युज यानाः । क्लियर यानातःगु सुपरनेटेन्तयात कोनिकल ग्लास इन्सर्ट (२०० μl आयतन) नापं २ एमएल अटोस्याम्पलर शीशीइ स्थानान्तरण या। नमूनाया विश्लेषण क्यू-एक्जाक्टिभ (क्यूई)-एचएफ (अल्ट्रा हाई फिल्ड अर्बिट्र्याप) हाई रिजोलुसन प्रिसिजन मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) नाप स्वाःगु एक्विटी आइक्लास अल्ट्रा हाई परफर्मेन्स एलसी सिस्टम (वाटर्स) छ्यला याःगु खः । विश्लेषणया निंतिं डेरिभेटाइज्ड नमूनाया २μl १००×१.० मिमी उच्च शक्तिया सिलिका टि ३ स्तम्भ (वाटर्स)य् १.८μm कण दूगु इन्जेक्सन याःगु खः । प्रवाह दर १००μl/min जुइ, व बफर प्रणालीइ बफर ए (१० एमएम एमोनियम फर्मेट व लःया ०.१५% फर्मिक एसिड) व बफर बी (एसीएन) दइ। ढाल थुकथं दु : ०%B ० मिनेटय्; ०% बि. ० निसें १५% बि ० निसें ०.१ मिनेटय्; १५ निसें १७% बि ०.१ निसें ०.५ मिनेटय्; बि १७ निसें ५५% ०.५ निसें १४ मिनेटय्; १४ निसें १४.५ मिनेटय् ५५ निसें ७०% बि; १८ मिनेटय् १४.५ निसें ७० निसें १००% बी; १८ निसें १९ मिनेटय् १००% बि; १९ निसें १९.१ मिनेटय् १०० निसें ०% बि; १९.१ निसें २८ मिनेट (५५, ५६) तक ०% बि । क्यूई-एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर ५० निसें ७५० m/z (मास/चार्ज रेसियो)या मास रेन्ज नापं सकारात्मक आयनाइजेसन मोडय् ज्या याइ।लागु रिजोलुसन ६०,००० ख, व प्राप्त गेन कन्ट्रोल (एजीसी) आयन लक्ष्य ३×१०६ ख, व अधिकतम आयन milli0conds ख। तापित इलेक्ट्रोस्प्रे आयनाइजेसन (ESI) स्रोत ३.५ kV स्प्रे भोल्तेज, २५०°C केशिका तापक्रम, ६० AU (स्वेच्छाचारी इकाइ)या म्याना वायु प्रवाह, व २० AU सहायक वायु प्रवाहय् ज्या याइ। २५०° से. एस लेन्स ६० एयूइ सेट यानातःगु दु ।
१३सि लेबल यानातःगु अर्गानिक एसिडया एनआयन क्रोमेटोग्राफी-एमएस विश्लेषण । ल्यं दुगु मेटाबोलाइट प्रेसिपिटेट (५५μl)यात क्यूई-एचएफ मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) नाप स्वानातःगु डायोनेक्स आयन क्रोमेटोग्राफी सिस्टम (ICS ५०००+, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) छ्यला विश्लेषण याःगु ख। संक्षेपय् धायेगु खःसा ५μl मेटाबोलाइट अर्कयात एचपीएलसी (२ मिमी×२५० मिमी, कण आकार ४μm, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) नापं सुसज्जित डायोनेक्स आयनप्याक एएस११-एचसी स्तम्भय् पुश-इन आंशिक लूप मोडय् १. )onया भरे यायेगु अनुपात नापं इन्जेक्सन याःगु खः । डायोनेक्स आयनप्याक एजी११-एचसी गार्ड स्तम्भ (२ एमएम x ५० एमएम, ४μm, थर्मो फिशर वैज्ञानिक)। स्तम्भया तापक्रम ३०° सेल्सियसय् तयातःगु दु, व अटोस्याम्पलरयात ६° सेल्सियसय् सेट यानातःगु दु। एलुएन्त जेनेरेटरया माध्यमं पोटासियम हाइड्रोक्साइड ग्रेडिएन्त दयेकेगु निंतिं डिआयोनाइज्ड लः नापं बियातःगु पोटासियम हाइड्रोक्साइड कार्ट्रिज छ्यलेगु या। ३८०μl/min या प्रवाह दरय् मेटाबोलाइटया पृथक्करण, क्वय् बियातःगु ढाल लागू यायेगु: ० निसें ३ मिनेट, १० mM KOH; ३ निसें १२ मिनेट, १० निसें ५० एमएम केओएच; १२ निसें १९ मिनेट, ५० निसें १०० एमएम केओएच; १९ निसें २१ मिनेट , १०० एमएम केओएच; २१ निसें २१.५ मिनेट, १०० निसें १० एमएम केओएच । १० एमएम केओएचया अन्तर्गत ८.५ मिनेटया निंतिं कोलुमयात हानं इक्विलिब्रेट यात ।
एलुतेद मेटाबोलाइटयात स्तम्भ धुंका १५०μl/min आइसोप्रोपानोल सप्लिमेन्ट स्ट्रिमनाप स्वाना नेगेटिभ आयनाइजेसन मोडय् संचालन जुइगु उच्च-रिजोलुसनया मास स्पेक्ट्रोमिटरय् निर्देशित याइ। एमएसं ६०,००० रिजोलुसनया लिसें एम/जेड ५० निसें ७५० तकया मास रेन्जया अनुगमन यानाच्वंगु दु । एजीसी १×१०६य् सेट यानातःगु दु, व दकलय् अप्व आयन ई १०० एमएसय् तयातःगु दु। क्वाकातःगु इएसआइ स्रोतयात ३.५ केभि स्प्रे भोल्टेजय् संचालन याःगु खः । आयन स्रोतया मेमेगु सेटिङ थुकथं दु: क्यापिलारी तापक्रम २७५°C; स्याथ ग्यास प्रवाह, ६० एयू; सहायक ग्यास प्रवाह, ३००° सेल्सियसय् २० एयू, व एस लेन्स ६० एयूइ सेटिङ।
१३सि लेबल यानातःगु मेटाबोलाइटया डाटा विश्लेषण । आइसोटोप अनुपातया डाटा विश्लेषणया निंतिं ट्रेसफाइन्डर सफ्टवेयर (भर्सन ४.२, थर्मो फिसर साइन्टिफिक) छ्यलादिसँ। प्रत्येक यौगिकया म्हसीकायात छगू विश्वसनीय सन्दर्भ यौगिकं प्रमाणित यानाः स्वतन्त्र रुपं विश्लेषण याःगु खः । आइसोटोप समृद्धि विश्लेषण यायेत प्रत्येक १३C आइसोटोप (Mn)या निष्कर्षित आयन क्रोमेटोग्राम (XIC)या क्षेत्रफल [M + H] + निसें पिकाःगु ख, गन n लक्ष्यित यौगिकया कार्बन ल्याः ख, गुकियात एमिनो एसिडया विश्लेषण यायेत छ्येलिगु या वा [ MH] + एनआयनया विश्लेषण यायेत छ्येलिगु या। एक्सआइसीया मास एक्युरेसी ५ भाग प्रति मिलियन स्वया म्हो जुइ, व आरटीया एक्युरेसी ०.०५ मिनेट जुइ। प्रत्येक लुयावःगु आइसोटोपया अनुपात व सम्बन्धित यौगिकया सकल आइसोटोपया योगया गणना याना समृद्धि विश्लेषण याइ। थ्व अनुपात प्रत्येक आइसोटोपया निंतिं प्रतिशत मूल्यया रुपय् बियातःगु दु, व लिच्वःयात मोलर प्रतिशत समृद्धि (MPE)या रुपय् व्यक्त यानातःगु दु, गुकियात न्हापा वर्णन यानातःगु दु (४२)।
फ्रोजन न्युरोन पेलेटयात आइस-कोल्ड ८०% मेथनोल (v/v)य् होमोजेनाइज याना भर्टेक्स याना -२०°Cय् ३० मिनेट तक्क इन्क्युबेट याना तःगु ख। नमूनायात हानं भर्टेक्स यानाः ३० मिनेटया निंतिं +४°C स संकि । नमूनायात २१,००० ग्रामय् ४° सेल्सियसय् ५ मिनेटया निंतिं सेन्ट्रिफ्युज यानाः लिपाया विश्लेषणया निंतिं २५° सेल्सियसय् स्पीडभ्याक कन्सेन्ट्रेटर छ्यला सुका काःगु खः । च्वय् वर्णन यानातःकथं, ल्ययातःगु कोषिकाया एमिनो एसिडय् एलसि-एमएस विश्लेषण याःगु खः । ट्रेसफाइन्डर (भर्सन ४.२, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) छ्येला प्रत्येक यौगिकया मोनोआइसोटोपिक मास छ्येला तथ्यांक विश्लेषण याःगु ख। मेटाबोलाइट डाटाया क्वांटाइल सामान्यीकरण प्रिप्रोसेसकोर सफ्टवेयर प्याकेज (५७) छ्यला याःगु ख।
कुचा तयारि । माउसयात याकनं हे कार्बन डाइअक्साइडं एनेस्थेसिया बियाः छ्यं क्वछुकल, मस्तिष्कयात याकनं हे क्वँय् पाखें लिकयाबिल, अले बरफं जाःगु कम्पनशील चाकु (एचएम-६५० भि, थर्मो फिशर साइन्टिफिक, वालडोर्फ, जर्मनी) छ्यला थुकियात ३०० निसें ३७५ μ% कार्बन ग्यास O५d ( Col2% gas O5d ) कथं चीकल । CO2) कम Ca2 + ACSF (१२५.० एमएम NaCl, २.५ एमएम KCl, १.२५ एमएम सोडियम फस्फेट बफर, २५.० एमएम NaHCO3, २५.० एमएम d-ग्लुकोज, १.० एमएम CaCl2 व ६.० एमएम Just to pH30 एमओएसएम)। प्राप्त मस्तिष्कया स्लाइसयात अप्वः Ca2 + ACSF (१२५.० एमएम NaCl, २.५ एमएम KCl, १.२५ एमएम सोडियम फस्फेट बफर, २५.० एमएम NaHCO3, २५.० एमएम d-ग्लुकोज, ४.० एमएम पीएच२एल व ४.० एमएम Ca3l) दुगु च्याम्बरय् स्थानान्तरण यानादिसँ । व ३१० निसें ३२० एमओएसएम)। रिकर्ड याये न्ह्यः स्लाइसयात २० निसें ३० मिनेट तक स्टोर यानादिसँ गुकिं यानाः रिकर्ड याये न्ह्यः उकियात हानं दयेके फइ ।
रिकर्डिङ्ग । फुक्क रेकर्डिङया निंतिं निश्चित रेकर्डिङ चेम्बर व २०x वाटर इमर्शन अब्जेक्टिभ लेन्स (साइन्टिफिका) दूगु माइक्रोस्कोप स्टेज छ्यःगु खः । पुटेटिभ पुर्किन्जे कोषयात (i) म्हया आकार, (ii) सेरिबेलमया एनातोमिकल थाय्, व (iii) फ्लोरोसेन्ट mtYFP रिपोर्टर जीनया अभिव्यक्तिं म्हसीकातःगु ख। ५ निसें ११ मेगोहमया टिप रेजिस्त्यान्स दूगु प्याच पिपेटयात बोरोसिलिकेट ग्लास क्यापिलारी (जीबी१५०-१०, ०.८६ एमएम×१.५ एमएम×१०० एमएम, साइन्स प्रोडक्ट्स, होफहेम, जर्मनी) व होरिजोन्टल पिपेट इन्स्ट्रुमेन्ट (पी-१००भाटर), नो०००ं पिने यंकि। फुक्क रेकर्डिङ ईएलसी-०३एक्सएस एनपीआई प्याच क्ल्याम्प एम्प्लिफायर (एनपीआई इलेक्ट्रोनिक जिएमबीएच, ट्याम, जर्मनी)ं याःगु ख, गुकियात सफ्टवेयर सिग्नल (भर्सन ६.०, क्याम्ब्रिज इलेक्ट्रोनिक, क्याम्ब्रिज, युके)ं नियन्त्रण याःगु ख। १२.५ केएचजेडया नमूना दरय् प्रयोग रिकर्ड याःगु खः । थ्व सिग्नलयात निगु शर्ट-पास बेसेल फिल्टरं क्रमशः १.३ व १० केएचजेडया कटअफ फ्रिक्वेन्सीइ फिल्टर याइ। मेम्ब्रेन व पिपेटया क्यापासिटेन्सयात एम्प्लिफायर छ्यला कम्पेन्सेशन सर्क्यूटं क्षतिपूर्ति याइ। फुक्क प्रयोग ओर्का-फ्ल्यास ४.० क्यामरा (हामामात्सु, गेर्डेन, जर्मनी)या नियन्त्रणय् याःगु ख, गुकियात होकावो सफ्टवेयर (भर्सन २.८, हामामात्सु, गेर्डेन, जर्मनी)ं नियन्त्रण याःगु ख।
नियमित होल-सेल कन्फिगरेसन व विश्लेषण। रेकर्ड याये न्ह्यः तुरुन्त हे पिपेटय् क्वय् बियातःगु पदार्थ दुगु आन्तरिक द्रावणं भरे यानादिसँ : ४.० एमएम केसीएल, २.० एमएम एनएसीएल, ०.२ एमएम ईजीटीए, १३५.० एमएम पोटासियम ग्लुकोनेट, १०.० एमएम हेपेस, ४.० एमएम गुफानो.टिपिसिन (टीएम५जी) (Na) व १०.० mM क्रिएटिनिन फस्फेटयात pH ७.२५य् समायोजन याना, व ओस्मोटिक प्रेशर २९० mOsm (सुक्रोज) जुल। झिल्लीयात फुटे यायेत ० pA बल छ्यलेधुंका तुरुन्त हे रेस्टिङ मेम्ब्रेनया पोटेंशियल मापन याःगु खः । इनपुट रेजिस्त्यान्सयात -४०, -३०, -२०, व -१० pA या हाइपरपोलाराइज्ड करेन्ट छ्यला मापेयाइ। भोल्टेज प्रतिक्रियाया परिमाण दाना स्व अले इनपुट रेजिस्टेन्सया गणना यायेत ओमया नियम छ्य । ५ मिनेटया निंतिं भोल्टेज क्ल्याम्पय् स्वतःस्फूर्त गतिविधि रेकर्ड यानातःगु ख, व एसपीएससीयात अर्धस्वचालित म्हसीका लिपि छ्यला इगोर प्रो (भर्सन ३२ ७.०१, वेभमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगन, अमेरिका)य् म्हसीका मापन याःगु ख। IV कर्भ व स्टेडी-स्टेट करेन्टयात ब्याट्रीयात थी-थी पोटेंशियलय् (-११० एमभी निसें न्ह्याका) क्ल्याम्प याना ५ एमभी स्टेपय् भोल्टेज अप्वयेकाः मापेयाइ। डिपोलाराइजिंग करेन्ट छ्यलाः एपि उत्पादनया परीक्षण याःगु खः । डिपोलाराइजिंग करेन्ट पल्स छ्यलेबलय् सेलयात -७० एमभिइ क्लाम्प या । प्रत्येक रेकर्डिङ्ग युनिटया स्टेप साइजयात बिस्कं बिस्कं (१० निसें ६० पिए) समायोजन या । दकलय् अप्वः एपि फ्रिक्वेन्सी जुइगु पल्स स्पाइकयात म्यानुअली ल्याः खानाः दकलय् अप्वः एपि फ्रिक्वेन्सीया गणना या । एपी थ्रेसहोल्डया विश्लेषण न्हापां छगू वा यक्व एपीयात ट्रिगर याइगु डिपोलाराइजेसन पल्सया निगुगु डेरिभेटिभ छ्येला याइ।
छेद दुगु प्याच कन्फिगरेसन व विश्लेषण । मानक प्रोटोकल छ्यलाः पर्फोरेटेड प्याच रेकर्डिङ्ग या । एटीपी- व जीटीपी-मुक्त पिपेट छ्यलादिसँ गुकिलि क्वय् बियातःगु तत्त्व मदु: १२८ एमएम ग्लुकोनेट के, १० एमएम केसीएल, १० एमएम हेपेस, ०.१ एमएम ईजीटीए व २ एमएम एमजीसीएल२, व पीएच ७.२ (KOH छ्यला)य् समायोजन यानादिसँ। कोष झिल्लीया अनियन्त्रित पारगम्यतायात पनेगु निंतिं इन्ट्रासेल्युलर द्रावणं एटिपि व जिटिपि त्वःती । प्याच पिपेटय् एम्फोटेरिसिन दूगु आन्तरिक द्रावण (लगभग २०० निसें २५० μg/ml; G4888, सिग्मा-एल्ड्रिच) तया छेद दूगु प्याचया अभिलेख प्राप्त याइ। एम्फोटेरिसिनयात डाइमिथाइल सल्फोक्साइडय् (अन्तिम एकाग्रता: ०.१ निसें ०.३%; डीएमएसओ; डी८४१८, सिग्मा-एल्ड्रिच) घुलनशील यानातःगु ख। अध्ययन यानातःगु न्युरोनय् छ्यःगु डिएमएसओया एकाग्रतां छुं नं उल्लेखनीय लिच्वः मलाकू । पन्चिङ प्रक्रियाया झ्वलय् च्यानल रेजिस्टेन्स (Ra)या निरन्तर अनुगमन यानातःगु ख, व Ra व AP या आयाम स्थिर जुइधुंका (२०-४० मिनेट) प्रयोग न्ह्याकूगु ख। स्वतःस्फूर्त गतिविधियात भोल्टेज व/बाय् करेन्ट क्लाम्पय् २ निसें ५ गू मिनेटया निंतिं दाना स्वइ । इगोर प्रो (भर्सन ७.०५.२, वेभमेट्रिक्स, अमेरिका), एक्सेल (भर्सन २०१०, माइक्रोसफ्ट कर्पोरेशन, रेडमण्ड, अमेरिका) व ग्राफप्याड प्रिज्म (भर्सन ८.१.२, ग्राफप्याड सफ्टवेयर इन्क, ला जोला, सीए) छ्यला तथ्यांक विश्लेषण याःगु खः । संयुक्त राज्य अमेरिका). स्वतःस्फूर्त एपियात म्हसीकेत, इगोरप्रोया न्यूरोमेटिक भि३.०सि प्लग-इन छ्यली । बियातःगु थ्रेसहोल्ड छ्यलाः एपियात स्वतः म्हसीकि, गुगु प्रत्येक रेकर्डया निंतिं व्यक्तिगत रुपं समायोजन जुइ । स्पाइक अन्तराल छ्यला, अधिकतम तत्काल स्पाइक फ्रिक्वेन्सी व औसत स्पाइक फ्रिक्वेन्सी नापं स्पाइक फ्रिक्वेन्सी निर्धारण या।
पिएन आइसोलेसन । न्हापा प्रकाशित प्रोटोकलयात अनुकूलित यानाः छगू निश्चित चरणय् माउस सेरिबेलमं पीएनयात शुद्ध याःगु खः (५८) । संक्षेपय्, सेरिबेलमयात आइस-कोल्ड डिसोसिएशन माध्यमय् [एचबीएसएस सिए२+ व एमजी२+ मदयेक, २० एमएम ग्लुकोज, पेनिसिलिन (५० यू/एमएल) व स्ट्रेप्टोमाइसिन (०.०५ एमजीएचबी/एमएल) (०.०५ एमजीएचबी/एमएल)या पूरक] विच्छेदन व चीका, व अनंलि माध्यमयात [एमजीएसएसएस११, पापापल१११ य् पूरक · पचय् यात। / एमएल), पपेन (१६ यू / एमएल) व डिओक्सीराइबोन्युक्लिज I (डीएनएज I; ०.१ एमजी/एमएल)] ३०°से.य् ३० मिनेटया निंतिं वासः यायेगु। न्हापां एचबीएसएस माध्यमय् अण्डा श्लेष्मा (१० एमजी/एमएल), बीएसए (१० एमजी/एमएल) व डीएनएज (०.१ एमजी/एमएल) दुगु कोथाया तापक्रमय् टिश्यूयात सिलेगु, अले एन्जाइमेटिक पाचनयात पनेगु निंतिं, अले २० एमएम ग्लुकोज दुगु एचबीएसएस माध्यमय्, एचबीलिन्माइसिन (स्ट्रेलिन्मिलएमएसएस)य् धीरे धीरे ग्राइन्डिङ यायेगु । (०.०५ एमजी/एमएल) व डिएनएज (०.१ एमजी/एमएल) छगू हे कोष पिकाइ । थुकिया लिच्वः कथं कोष निलम्बनयात ७०μm कोष स्ट्रेनरया माध्यमं फिल्टर यानाः कोषयात सेन्ट्रिफ्युगेसन (१११० rpm, ५ मिनेट, ४°C) यानाः पेलेट यानाः सर्टिंग माध्यमय् [HBSS, २० mM ग्लुकोज, २०% भ्रूण स्ट्रेमाइल व २०% भ्रूण बोभाइल) सीरम, ४°C पूरक कथं पुनःनिलम्बन याःगु खः । (०.०५ एमजि/मिलि)]; प्रोपिडियम आयोडाइडं कोषया व्यवहार्यताया मूल्यांकन यायेगु व कोषया घनत्व १×१०६ निसें २×१०६ कोष/मिलिइ समायोजन यायेगु। फ्लो साइटोमेट्री याये न्ह्यः, सस्पेन्सनयात ५० माइक्रोमिटर सेल स्ट्रेनरं फिल्टर याःगु खः ।
फ्लो साइटोमीटर। कोष वर्गीकरण ४° सेल्सियसय् एफएसीएसएरिया III मेसिन (बीडी बायोसाइन्सेस) व एफएसीएसडीभा सफ्टवेयर (बीडी बायोसाइन्सेस, भर्सन ८.०.१) छ्यला याःगु ख। सेल सस्पेन्सनयात २० psi या दबावय् १०० μm नोजल छ्यला ~२८०० इभेन्ट/सेकेण्डया दरं क्रमबद्ध याःगु ख। परम्परागत गेटिङ मापदण्ड (कोष आकार, बाइमोडल विभेद, व स्केतेरिङ विशेषता)ं मेमेगु कोष प्रकारं पीएनया सही अलगाव सुनिश्चित यायेमफुगुलिं माइटोवाईएफपी+ व नियन्त्रण माइटोवाईएफपी −य् वाईएफपी तीव्रता व अटोफ्लोरोसेन्सया प्रत्यक्ष तुलनाया आधारय् गेटिङ रणनीति दयेकिगु या। वाईएफपीयात ४८८ एनएम लेजर लाइनं नमूनायात विकिरणित याना उत्तेजित याइ, व ५३०/३० एनएम ब्याण्ड पास फिल्टर छ्येला सिग्नल लुइकिगु या। माइटोवाईएफपी+ मुस्याय् रोजा२६-माइटोवाईएफपी रिपोर्टर जीनया सापेक्षिक शक्ति नं न्युरोनल बडि व एक्सोनया टुक्रायात छुटे यायेत छ्येलिगु या। ७-एएडीयात ५६१ एनएमया ह्याउँगु लेजरं उत्तेजित याइ व ६७५/२० एनएमया ब्यान्डपास फिल्टरं सीपिं कोषयात पिने तयेत डिटेक्ट याइ। छगू हे इलय् एस्ट्रोसाइट्सयात अलग यायेत सेल सस्पेन्सनयात एसीएसए-२-एपीसीं दाग तल, अनंलि नमूनायात ६४० एनएम लेजर लाइनं विकिरणित यात, व ६६०/२० एनएम ब्यान्डपास फिल्टर छ्यला सिग्नल लुइकल।
संकलन जूगु कोषयात सेन्ट्रिफ्युगेसन (१११० आरपीएम, ५ मिनेट, ४°C) याना पेलेट याना -८०°Cय् छ्यलेगु ई तक्क भण्डारण यानातःगु ख। प्रक्रियात्मक परिवर्तनशीलता म्हो यायेत Mfn2cKO छुँ व इमिगु लिटर पपयात छगू हे न्हिइ वर्गीकृत याइ। एफएसीएस डाटा प्रस्तुति व विश्लेषण फ्लोजो सफ्टवेयर (फ्लोजो एलएलसी, एशल्याण्ड, ओरेगन, अमेरिका) छ्यला याःगु ख।
क्वय् न्ह्यथनातःकथं (५९) रियल-टाइम पीसीआर लिपाया mtDNA क्वांटिफिकेशनया निंतिं क्रमबद्ध न्युरोनं DNA अलग यायेत छ्यलिगु या। न्हापां थीथी ल्याखय् कोषय् क्यूपीसीआर चले यानाः रेखीयता व थ्रेसहोल्ड संवेदनशीलताया परीक्षण याःगु खः । संक्षेपय् धायेगु खःसा ५० एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच ८.५), १ एमएम ईडीटीए, ०.५% ट्वीन २० व प्रोटिनेज के (२०० एनजी/एमएल) दूगु लाइसिस बफरय् ३०० पीएन मुंकाः ५५°से १२० मिनेट इन्क्युबेट यायेगु याइ । प्रोटिनेज केया पूर्ण निष्क्रियता सुनिश्चित यायेत कोषयात ९५° सेल्सियसय् १० मिनेटया निंतिं हाकनं इन्क्युबेट यानातःगु ख।mt-Nd1 या निंतिं विशिष्ट TaqMan प्रोब (थर्मो फिशर) छ्यला mtDNAयात ७९००HT रियल-टाइम Fificisher SPCR सिस्टम (Therificer PCR)य् सेमि-क्वान्टिटेटिभ PCR पाखें मापन याःगु ख। विज्ञान, कैटलग नम्बर Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर वैज्ञानिक, कैटलग नम्बर AIVI3E8) व 18S (थर्मो फिशर वैज्ञानिक, कैटलग नम्बर Hs99999901_s1) जीन।
प्रोटिओम नमूना तयार यायेगु । १० मिनेटया निंतिं ९५° सेल्सियसय् समाधानयात तापयेकाः व सोनिकेटिङ यानाः, लाइसिस बफरय् [६ एम ग्वानिडिन क्लोराइड, १० एमएम ट्रिस (२-कार्बोक्सीथाइल) फस्फिन हाइड्रोक्लोराइड, १० एमएम क्लोरोएसिटामाइड व १०० एमएम ट्रिस- एचसी पेलेट फ्रोजन न्युरोनय्] । १० मिनेटया निंतिं बायोरप्टर (डायजेनोड)य् (३० सेकेण्ड पल्स / ३० सेकेण्ड पज अवधि) । नमूनायात २० एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच ८.०)य् १:१० पातला याना ३०० एनजी ट्रिप्सिन गोल्ड (प्रोमेगा) नापं ल्वाकछ्याना ३७° सेल्सियसय् चान्हय् इन्क्युबेट याना पूर्ण पाचन प्राप्त याइ। निन्हुखुन्हु, नमूनायात २०,००० ग्रामय् २० मिनेटया निंतिं सेन्ट्रिफ्यूज यात । सुपरनेतेन्तयात ०.१% फर्मिक एसिडं पातला याना, व द्रावणयात थःम्हं दयेकूगु स्टेजटिप्सं डिसाल्ट यानातःगु ख। नमूनायात स्पीडभ्याक उपकरण (एपेन्डोर्फ कन्सेन्ट्रेटर प्लस ५३०५)य् ४५° सेल्सियसय् सुकातःगु ख, व अनंलि पेप्टाइडयात ०.१% फर्मिक एसिडय् निलम्बित यानातःगु ख। दक्वं नमूना छक्वलं छम्ह हे मनुखं तयार याःगु खः । एस्ट्रोसाइट नमूनाया विश्लेषण यायेत ४ μg डिसाल्टेड पेप्टाइडयात ट्यान्डेम मास ट्याग (TMT10plex, क्याटलग नम्बर ९०११०, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) नापं पेप्टाइड व TMT रिएजेन्ट अनुपात १:२०या लेबल तःगु ख। टिएमटी लेबलिङया निंतिं ०.८ mg टिएमटी रिएजेन्टयात ७० μl एनहाइड्रस एसीएनय् पुनःसस्पेन्ड यानातःगु ख, व सुख्खा पेप्टाइडयात ९ μl ०.१ एम टीईएबी (ट्राइएथिलामोनियम बाइकार्बोनेट)य् पुनर्गठन यानातःगु ख, गुकिलि एसीएनय् ७ μl टिएमटी रिएजेन्त तःगु ख। एकाग्रता ४३.७५% दुगु खः । ६० मिनेट इन्क्यूबेशन यायेधुंका, २ μl ५% हाइड्रोक्सिलामिनं प्रतिक्रियायात स्याकल। लेबल यानातःगु पेप्टाइडयात मुंकाः सुकाः २००μl ०.१% फर्मिक एसिड (एफए)य् पुनःसस्पेन्ड यानाः निगू ब्वय् ब्वथलाः थःम्हं हे दयेकूगु स्टेजटिप्स छ्यला डिसाल्ट यानातःगु खः । अल्टिमेट ३००० अल्ट्रा हाई परफर्मेन्स लिक्विड क्रोमेटोग्राफ (अल्टिमेट ३००० अल्ट्रा हाई परफर्मेन्स लिक्विड क्रोमेटोग्राफ) छ्यला निगु आधा भाग मध्ये छगूयात १३०Å१.७μm C१८ कणं जाःगु १mm x १५०mm एक्विटी क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भय् फ्राक्सन यानातःगु ख (NoWaters.SKU6050)। थर्मो फिशर वैज्ञानिक)। ३०μl/min या प्रवाह दरय् पेप्टाइड अलग यायेगु, १% निसें ५०% बफर बी ८५ मिनेटया निंतिं ९६ मिनेटया स्टेपवाइज ग्रेडिएन्त नापं अलग यायेगु, ५०% निसें ९५% बफर बी ३ मिनेटया निंतिं अलग यायेगु, अनंलि ९५ % बफर बीया निंतिं ८ मिनेट; बफर ए ५% एसीएन व १० एमएम एमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) ख, व बफर बी ८०% एसीएन व १० एमएम एबीसी ख। ३ मिनेटय् छक्वः अंश मुंकाः निगू पुचलय् (१ + १७, २ + १८ आदि) स्वानाः भ्याकुम सेन्ट्रिफ्युजय् सुकादिसँ ।
एलसि-एमएस/एमएस विश्लेषण । मास स्पेक्ट्रोमेट्रीया निंतिं पेप्टाइड (नम्बर r119.aq) यात २५ सेमि, ७५ माइक्रोमिटर दुनेया व्यासया पिकोफ्रिट एनालिटिकल कोलम (न्हुगु वस्तुगत लेन्स, भाग ल्याः PF7508250)य् १.९ माइक्रोमिटर ReproSil-Pur matchAse, C.Qrse,120 नापं सुसज्जित यानातःगु ख। EASY-nLC 1200 (थर्मो फिशर वैज्ञानिक, जर्मनी)। कोलुमयात ५० डिग्री सेल्सियसय् तयातल । बफर ए व बी लःया ०.१% फर्मिक एसिड व ८०% एसीएनय् ०.१% फर्मिक एसिड दइ । पेप्टाइडयात २०० एनएल/मिनेटया स्टेपवाइज ग्रेडिएन्तं ६% निसें ३१% बफर बी ६५ मिनेट, व ३१% निसें ५०% बफर बी ५ मिनेट तक्क अलग याःगु ख। एलुतेद पेप्टाइडयात अर्बिट्राप फ्युजन मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक)य् विश्लेषण याःगु ख। पेप्टाइड प्रिकर्सर m/z मापन ३५० निसें १५०० m/z या दायराय् १२०,०००या रिजोलुसनय् याइ। २७% सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा छ्येला २ निसें ६ चार्ज अवस्था दूगु दकलय् बल्लाःगु प्रिकर्सरयात उच्च ऊर्जा सी ट्र्याप डिसोसिएशन (एचसीडी) क्लिभेजया निंतिं ल्यइ। चक्रया ई १ एसय् सेट यात । दकलय् चिधंगु एजीसी लक्ष्य ५×१०४ व दकलय् अप्व इन्जेक्सन ई ८६ एमएस छ्यला आयन ट्र्यापय् पेप्टाइड टुक्राया m/z मूल्य मापन याःगु ख। खण्डित जुइधुंकाः, पूर्ववर्तीयात ४५ एसया निंतिं गतिशील बहिष्करण धलखय् तःगु खः । टिएमटि-लेबल यानातःगु पेप्टाइडयात ५० सेमि, ७५ माइक्रोमिटर एक्लेम पेपम्याप स्तम्भ (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, क्याटलग ल्याः १६४९४२)य् अलग यानातःगु ख, व माइग्रेसन स्पेक्ट्रायात अर्बिट्र्याप लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर हाईप्प्पेडफर्म विदभ) कथं विश्लेषण याःगु ख। (FAIMS) उपकरण (थर्मो फिसर साइन्टिफिक) −५० व −७० V या निगु क्षतिपूर्ति भोल्टेजय् ज्या याइ।सिंक्रोनाइजेसन प्रिकर्सरया आधारय् ल्यःगु MS3 टिएमटी रिपोर्ट आयन सिग्नल मापनया निंतिं छ्येलिगु या। पेप्टाइड पृथक्करण EASY-nLC १२००य् ९०% रेखीय ढाल एलुसन छ्येला, ६% निसें ३१% बफर एकाग्रता नापं याःगु ख; बफर ए ०.१% एफए, व बफर बी ०.१% एफए व ८०% एसीएन ख। विश्लेषणात्मक स्तम्भ ५० डिग्री सेल्सियसय् चले जुइ । एफएआईएमएस कम्पेन्सेशन भोल्टेज कथं मूल फाइलयात विभाजित यायेत फ्रीस्टाइल (भर्सन १.६, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) छ्यलादिसँ ।
प्रोटिन म्हसीका व परिमाणन। एकीकृत एन्ड्रोमेडा सर्च इन्जिन छ्यला मूल तथ्यांकयात म्याक्सक्वान्ट भर्सन १.५.२.८ (https://maxquant.org/) छ्यला विश्लेषण याःगु खः । एक्वोरिया भिक्टोरियां प्राप्त जूगु Cre रिकम्बिनेज व YFP सिक्वन्सया नापं पेप्टाइड फ्र्याग्मेन्ट स्पेक्ट्राय् माउस रेफरेन्स प्रोटिओमया क्यानोनिकल सिक्वन्स व आइसोफर्म सिक्वन्स मालेगु ज्या जुल (प्रोटिओम आईडी UP000000589, मे2000 य् UniProt)7 य् डाउनलोड याःगु खः । मेथियोनिन अक्सिडेसन व प्रोटिन एन-टर्मिनल एसिटाइलेसनयात भेरिएबल मोडिफिकेशनया रुपय् सेट याःगु ख; सिस्टिन कार्बामोइल मिथाइलेसनयात निश्चित परिमार्जनया रुपय् सेट याःगु खः । पाचनया मापदण्ड “विशिष्टता” व “ट्रिप्सिन/पी”य् सेट यानातःगु दु । प्रोटिन म्हसीकेत छ्यलिगु पेप्टाइड व रेजर पेप्टाइडया न्यूनतम ल्याः १; न्यूनतम अद्वितीय पेप्टाइडया ल्याः ० ख।पेप्टाइड नक्सा मिलानया शर्तय् प्रोटिन पहिचान दर ०.०१ ख। “निगूगु पेप्टाइड” विकल्प चायेकातःगु दु । थीथी मूल फाइलया दथुइ सफल पहिचान हस्तान्तरण यायेत “रनया दथुइ मेल” विकल्प छ्यलादिसँ । लेबल-मुक्त परिमाणन (एलएफक्यू) (६०) या निंतिं एलएफक्यू न्यूनतम अनुपात ल्याः १ छ्यलादिसँ । एलएफक्यू तीव्रता प्रत्येक ई बिन्दुइ म्हो ल्याखय् छगू जीनोटाइप पुचलय् कम्ती नं निगु वैध मूल्यया निंतिं फिल्टर याइ, व चौडाइ दूगु सामान्य वितरणं एक्स्ट्रापोलेसन याइ। ०.३ अले १.८ क्वय् हुँ । एलएफक्यूया लिच्वःया विश्लेषण यायेत पर्सियस कम्प्युटिङ प्लेटफर्म (https://maxquant.net/perseus/) व आर (https://r-project.org/) छ्यलादिसँ । डिफरेन्सियल एक्सप्रेसन एनालिसिसया निंतिं लिम्मा सफ्टवेयर प्याकेजं निगु पक्षीय मध्यम टि परीक्षण छ्यःगु ख (६१)। अन्वेषणात्मक तथ्यांक विश्लेषण जिजिप्लट, फ्याक्टोमाइनआर, फ्याक्टोएक्स्ट्रा, जिग्याली व फीटम्याप छ्यलाः याइ । टिएमटि-आधारित प्रोटिओमिक्स डाटायात म्याक्सक्वान्ट भर्सन १.६.१०.४३ छ्यला विश्लेषण याःगु खः । सन् २०१८ या सेप्टेम्बरय् डाउनलोड जूगु युनिप्रोटया ह्युमन प्रोटिओमिक्स डाटाबेसपाखें कच्चा प्रोटिओमिक्स डाटा मालेगु, विश्लेषणय् निर्मातां बियातःगु आइसोटोप शुद्धता सुधार कारक दुथ्याकातःगु दु । डिफरेन्सियल एक्सप्रेसन एनालिसिसया निंतिं आरय् लिम्मा छ्य । मूल डाटा, डाटाबेस मालेगु लिच्वः, व डाटा विश्लेषण कार्यप्रवाह व लिच्वः फुक्कं डाटा सेट पहिचानकर्ता PXD019690 नापं PRIDE पार्टनर रिपोजिटरी मार्फत प्रोटिओमएक्सचेन्ज गठबन्धनय् भण्डारण यानातःगु दु।
फंक्शनल एनोटेशनं विश्लेषणयात समृद्ध याइ । ८ वालय् डेटा सेटया फंक्शनल एनोटेशन टर्मया समृद्धि निर्धारण यायेत इन्जेनुइटी पाथवे एनालिसिस (क्यूआईएजेन) उपकरण छ्यःगु खः (चित्र १) । संक्षेपय्, एलसी-एमएस/एमएस (ट्यान्डेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) तथ्यांक विश्लेषणं प्राप्त परिमाणात्मक प्रोटिन धलःयात क्वय् बियातःगु फिल्टर मापदण्ड नापं छ्येलिगु या: मस मस्कुलसयात प्रजाति व पृष्ठभूमिया रुपय् ल्यइ, व श्रेणीइ बेन्जामिनीं ०.०५ वा व स्वया म्हो समृद्धिया निंतिं समायोजित पी मूल्य क्यनिगु महत्त्वपूर्ण मानेयाइ। थ्व ग्राफया निंतिं समायोजित पी मानया आधारय् प्रत्येक क्लस्टरय् शीर्ष न्यागू अतिरिक्त श्रेणी क्यनातःगु दु। मल्टिपल टि-टेस्ट छ्येला, बेन्जामिनी, क्रिगर, व येकुतिएली (Q = ५%)या निगु चरणया रेखीय बूस्ट प्रोग्राम छ्येला, प्रत्येक श्रेणीइ म्हसीकातःगु महत्त्वपूर्ण उम्मेदवारय् ई-कोर्स प्रोटिन अभिव्यक्ति विश्लेषण याइ, व प्रत्येक पंक्तियात ब्यागलं ब्यागलं विश्लेषण याइ। छगू स्थीर एसडीयात नालेमाःगु आवश्यकता मदु ।
थ्व अध्ययनया लिच्वःयात प्रकाशित डाटाबेसनाप तुलना यायेत व चित्र १ य् भेन डायग्राम दयेकेगु निंतिं जिमिसं मात्रात्मक प्रोटिन धलःयात माइटोकार्टा २.० एनोटेशन (२४) नापं स्वाना। डायग्राम दयेकेगु निंतिं अनलाइन टूल ड्र भेन डायग्राम (http://बायोइन्फर्मेटिक्स.psb.ugent.be/वेबटुल्स/भेन/) छ्यलादिसँ ।
प्रोटिओमिक्स विश्लेषणया निंतिं छ्यलिगु तथ्यांकीय प्रक्रियाया विस्तृत जानकारीया निंतिं कृपया सामग्री व विधिया सम्बन्धित खण्ड स्वयादिसँ। मेगु फुक्क प्रयोगया निंतिं, पूवंक जानकारि स्वापू दुगु किम्बदन्तिइ लुइके फै । मेगु कथं निर्दिष्ट मजूतले फुक्क तथ्यांकयात औसत ± एसईएमया रुपय् व्यक्त याइ, व फुक्क तथ्यांकीय विश्लेषण ग्राफप्याड प्रिज्म ८.१.२ सफ्टवेयर छ्यला याःगु ख।
थुगु च्वसुया निंतिं पूरक सामाग्रीया निंतिं, http://एडभान्सेस.साइन्सम्याग.ओर्ग/सिजिआइ/कन्टेन्ट/फुल/६/३५/इएबा८२७१/डिसि१ स्वयादिसँ ।
थ्व क्रिएटिभ कमन्स एट्रिब्युसन-गैर-व्यावसायिक लाइसेन्सया शर्त अन्तर्गत वितरण यानातःगु खुल्ला पहुँच च्वसु खः, गुकिं छुं नं माध्यमय् छ्यलेगु, वितरण यायेगु व पुनरुत्पादन यायेगु अनुमति बी, गुबले तक अन्तिम छ्यलाबुला व्यावसायिक लाभया निंतिं मखु व मूल कृति सही जुइगु आधार जुइ । भोंदां।
नोट : जिमिसं छितः छिगु इमेल एड्रेस बियादिसँ धकाः जक धायेगु यानाच्वना, गुकिं छिं पेजय् सिफारिस यानादीम्ह मनुखं छिं इमेल स्वयेगु इच्छा यानादीगु व स्पाम मखु धकाः सीके फइ । जिमिसं छुं नं इमेल एड्रेस काये मखु ।
छि आगन्तुक खः ला धकाः जाँच यायेत व स्वचालित स्पाम दुथ्याकेगु ज्यायात पनेगु निंतिं थुगु न्ह्यसः छ्यली ।
ई. मोटोरी, आई. लार्सन
डिसफंक्शनल न्युरोनया प्रोटिओमिक्स विश्लेषणं न्युरोडिजेनेरेसनयात प्रतिकार यायेत मेटाबोलिक प्रोग्राम सक्रिय जुइगु खने दु।
ई. मोटोरी, आई. लार्सन
डिसफंक्शनल न्युरोनया प्रोटिओमिक्स विश्लेषणं न्युरोडिजेनेरेसनयात प्रतिकार यायेत मेटाबोलिक प्रोग्राम सक्रिय जुइगु खने दु।
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