कोष कम्पार्टमेन्टलाइजेशन व होमियोस्टेसिस कायम यायेत सेक्रेटरी पथवेय् प्रोटिन सर्ट यायेगु आवश्यक जुइ। शेल-मध्यस्थता वर्गीकरणया नापं, सेक्रेटरी ट्रान्सपोर्टया प्रक्रियाय् किनेसिन वर्गीकरणय् लिपिडया भूमिका ताःई न्ह्यःनिसेंया आधारभूत न्ह्यसः ख गुकिया लिसः आःतक्क मवःनि। थन, जिमिसं 3D छगू हे इलय् बहुरंगी उच्च-रिजोलुसन रियल-टाइम इमेजिङ यानाः इन भिभोय् प्रमाणित याइ कि न्हूगु संश्लेषित ग्लाइकोसिलफोस्फेटिडाइलिनोसिटोल-इमोबिलाइज्ड प्रोटिन तसकं ताःहाकःगु सेरामाइड लिपिड मोइटीजलिसे क्लस्टर यानाः विशेष एन्डोप्लाज्मय् वर्गीकृत जुइ नेट ट्रान्सम्ब्रेनमेमं निकास साइटपाखें, गुगु खः । नापं, जिमिसं क्यना कि थ्व वर्गीकरण चयनात्मकताया निंतिं एन्दोप्लाज्मिक रेटिक्युलम मेम्ब्रेनय् सेरामाइडया चेन लम्बाइ महत्वपूर्ण ख। जिमिगु अध्ययनं लिपिड चेन लम्बाईया आधारय् प्रोटिन कार्गोयात सेक्रेटरी पथय् चयनात्मक निर्यात थासय् वर्गीकृत यायेगु न्हापांगु प्रत्यक्ष इन भिभो प्रमाण प्रदान याइ।
युकेरियोटिक कोषय् एन्दोप्लाज्मिक रेटिक्युलम (ईआर)य् संश्लेषित प्रोटिनयात थःगु उपयुक्त कोशिकीय गन्तव्यय् थ्यंकेगु निंतिं सेक्रेटरी पथ जुया ढुवानीया इलय् क्रमबद्ध याइ (१)। कोट-मध्यस्थता वर्गीकरणया नापं, थ्व ताःई न्ह्यःनिसें अनुमान यानातःगु ख कि छुं लिपिडं नं विशिष्ट झिल्ली डोमेनय् क्लस्टर याना विशिष्ट प्रोटिन (२-५) चयनात्मक निकास बिन्दुया रुपय् ज्या यायेफु। अथे जुसां थ्व सम्भावित लिपिड-आधारित संयन्त्रयात प्रमाणित यायेत प्रत्यक्ष इन भिभो प्रमाणया अभाव आः नं दनि। थ्व आधारभूत समस्या समाधान यायेत जिमिसं खमीरय् ग्लाइकोसिलफोस्फेटिडाइलिनोसिटोल (जीपीआई) एन्कर प्रोटिन (जीपीआई-एपी) ईआरं गथे यानाः भिन्न रुपं निर्यात जुइ धकाः अध्ययन याना। जीपीआई-एपीत थी-थी लिपिड-नाप स्वाःगु कोष सतहया प्रोटिन ख ( ६, ७)। जिपिआइ-एपि ग्लाइकोलिपिड मोइति (जिपिआइ एन्कर)या माध्यमं प्लाज्मा मेम्ब्रेनया पिनेया पत्रिकाय् स्वानाच्वंगु छगू स्रावित प्रोटिन ख। इमिसं ईआर लुमेनय् कन्जरभेटिभ पोस्ट-ट्रान्सलेशनल मोडिफिकेशनया रुपय् जिपिआइ एन्करयात स्वीकार याइ (८)। एट्याचमेन्ट जुइधुंका जीपीआई-एपी गोल्जी उपकरण (५, ९) जुया ईआरं प्लाज्मा मेम्ब्रेनय् वनि। जीपीआई एन्करया उपस्थितिं जीपीआई-एपीयात ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटिन (मेमेगु प्लाज्मा मेम्ब्रेन प्रोटिन नापं) स्वया ब्यागलं कथं स्रावित लँपुइ यंकिगु याइ (५, ९, १०)। खमीर कोषय् जीपीआई-एपीयात एन्दोप्लाज्मिक रेटिक्युलमय् मेमेगु स्रावित प्रोटिन स्वया अलग याइ, व लिपा कोट प्रोटिन कम्प्लेक्स II (COPII) (६, ७)ं त्वपुया तःगु अद्वितीय भेसिकलय् प्याकेज याइ। ईआर निर्यात प्रक्रियाय् थ्व वर्गीकरण प्रक्रियाया निर्धारकत स्पष्ट मजू, तर थ्व संयन्त्रयात लिपिडया आवश्यकता जुइफु, विशेष यानाः जीपीआई लंगरया लिपिड भागया संरचनात्मक पुनःनिर्माणया आवश्यकता जुइफु धकाः अनुमान यानातःगु दु (५, ८)। खमीरय् जीपीआई लिपिड रिमोडेलिङ तुरुन्त हे जीपीआई स्वायेधुंका न्ह्याइ, व यक्व अवस्थाय् थुकिलिं सेरामाइड २६-कार्बन लङ्ग-चेन सेचुरेटेड फ्याटी एसिड (C26:0) (११, १२) नाप स्वापू तइ। आःतक खमीर कोषिकां उत्पादन याःगु मू सेरामाइड सि२६ सेरामाइड खः । थ्व ईआरय् संश्लेषण जुइ व थ्व अप्व भाग सीओपीआईआई भेसिकल्सया माध्यमं गोल्जी उपकरणय् निर्यात जुइ (१३)। जीपीआई-एपीया ईआर निर्यातया निंतिं विशेष रुपं निरन्तर सेरामाइड संश्लेषणया आवश्यकता जुइ (१४, १५), व थुकिया लिच्वः कथं गोल्जी उपकरणय् सेरामाइडया इनोसिटोल फस्फेट सेरामाइड (आईपीसी)य् हिलेगु ज्या जीपीआई एंकर संश्लेषणय् निर्भर जुइ (१६)। कृत्रिम झिल्ली नापंया बायोफिजिकल अध्ययनं क्यंगु दु कि तसकं ताःहाकःगु एसिल चेन सेरामाइडं विशिष्ट भौतिक गुण दूगु अर्डर डोमेन दयेकेफु (१७, १८)। थ्व तथ्यांकं थ्व परिकल्पना याइ कि सी२६ सेरामाइड व सी२६ सेरामाइड नापंया जीपीआई-एपीं थःगु भौतिक गुण छ्येला अपेक्षाकृत गन्दा ईआर झिल्ली लिपिड वातावरणय् व्यवस्थित क्षेत्र वा क्षेत्रय् एकीकृत जुइ। थ्व मू कथं चिहाकःगु व असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड (C16:1 व C18:1) (१९, २०)ं दयेकिगु या। थ्व क्षेत्रत विशिष्ट ईआर निकास स्थल (ईआरईएस)य् चयनात्मक रुपं केन्द्रित जुइ, गन सेरामाइड व सेरामाइड-आधारित जीपीआई-एपीयात छगू हे समर्पित सीओपीआईआई भेसिकलय् गोल्जीइ सह-ढुवानी यायेछिं (५)।
थुगु अध्ययनय् जिमिसं सुपर-रिजोलुसन कन्फोकल रियल-टाइम इमेजिङ माइक्रोस्कोपी (एससीएलआईएम) छ्यला थ्व लिपिड-आधारित संयन्त्रया प्रत्यक्ष परीक्षण यानागु दु, गुगु छगू अत्याधुनिक सेल माइक्रोस्कोपी प्रविधि खः गुकिं छगू हे इलय् फ्लोरोसेन्ट लेबल यानातःगु प्रोटिनया अवलोकन यायेफइ । (२१, २२)
जिमिसं दकलय् न्हापां एस सेरेभिसियाय् ईआर त्वःतेधुंका ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटिनपाखें सी२६ सेरामाइड समूह दूगु सामान्य जीपीआई-एपीयात गथे यानाः स्क्रीन याःगु खः धकाः अझ परिभाषित यायेत एससीएलआईएम प्रविधि लागू यानागु खः । ईआरया वर्गीकरण जाँच यायेत जिमिसं छगू आनुवंशिक प्रणाली छ्यला गुकिलिं न्हुगु संश्लेषित कार्गो इन भिभोय् ईआरईएसय् दुहां वइगु प्रत्यक्ष कल्पना यायेफु (७, २३)। कार्गोया रुपय् जिमिसं ग्रीन फ्लोरोसेन्ट प्रोटिन (जीएफपी) नापं लेबल यानातःगु सी २६ सेरामाइड-आधारित जीपीआई-एपी ग्यास १ व निकट-इन्फ्रारेड फ्लोरोसेन्ट प्रोटिन (आईआरएफपी) नापं लेबल यानातःगु ट्रान्समेम्ब्रेन सेक्रेटेड प्रोटिन मिड२ ल्यया, गुकिलिं निगुलिं प्लाज्मा मेम्ब्रेनयात लक्षित याइ (२४–२६)। sec31-1 तापक्रम-संवेदनशील म्युटेन्टय् थ्व निगु कार्गो छगू ग्यालाक्टोज-इन्दुसिबल प्रोमोटर व छगू संवैधानिक ERES मार्करया अन्तर्गत अभिव्यक्त जुइ। चरम तापक्रम (३७°C)य्, छाय् धाःसा sec31-1 म्युतेसनं COPII कोट कम्पोनेन्ट Sec31या ज्यायात प्रभावित याना COPII अंकुरण व ईआर निर्यातयात पनेगु ज्या याइ, न्हुगु संश्लेषित कार्गो ईआरय् मुनाच्वनि (२३)। म्हो तापक्रम (२४°C)य् ख्वाउँकेधुंका sec31-1 म्युटेन्ट सेलत सेक्रेटरी क्षेत्रं रिकभरी जुल, व मुनाच्वंगु न्हुगु सिन्थेटिक कार्गो ईआरं निर्यात यायेगु शुरु जुल। क्लिम भिजुअलाइजेसनं क्यंगु दु कि न्हुगु संश्लेषण जूगु अप्व Gas1-GFP व Mid2-iRFP ३७°Cय् इन्क्युबेशन यायेधुंका sec31-1 म्युटेन्ट कोषया ERय् अझ नं मुनाच्वंगु दु व अनंलि २४°Cय् ५ मिनेटया निंतिं पिहां वयाच्वंगु दु (चित्र १)। मिड२-आइआरएफपी मुक्कं ईआर झिल्लीइ वितरण जुइगुलिं, व ग्यास१-जीएफपी असतत ईआर झिल्ली क्षेत्रय् केन्द्रित व मुनाच्वंगुलिं इमिगु वितरण बिल्कुल हे फरक जुइ (चित्र १, ए निसें सी व मूभि एस १)। थ्व बाहेक, किपा १डीइ क्यनातःकथं, ग्यास१-जीएफपी क्लस्टरय् मिड२-आइआरएफपी मदु। थ्व लिच्वःतेसं जीपीआई-एपी व ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटिनयात न्हापा हे थी-थी ईआर मेम्ब्रेन क्षेत्रय् अलग यानातःगु संकेत बी। ग्यास१-जीएफपी क्लस्टर एमचेरीया सीओपीआईआई कोट प्रोटिन सेक१३ (चित्र १, ई व एफ, व मूभि एस१) (२३) नापं लेबल यानातःगु छगू विशिष्ट ईआरईएसया लिक्क ला।
sec31-1 कोशिकां ग्यालेक्टोज-प्रेरित स्राव, छगू ​​ताःहाकःगु एसिल श्रृंखला (C26) सेरामाइड GPI-AP ग्यास1-GFP (GPI-AP, हरित) व ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटिन Mid2-iRFP (TMP, वँचुगु) व्यक्त याइ व थ्व रचनात्मक ERES लेबलिङ Sec13-mESbarry, 2018 य् magenta30 य् जूगु खः । मिनेट, २४° सेल्सियसय् यंकल, व ५ मिनेट लिपा एससीएलआईएमं इमेज यात। (ए निसें सी) छगू समतलया प्रतिनिधि मर्ज वा एकल २डी छवि (ए), १० जेड-सेक्सनया २डी प्रोजेक्सन छवि (बी) वा कार्गो व ईआरईएस मार्करया ३डी सेल हेमिस्फीयर छवि (सी) क्यनि। स्केल बार १μm (ए व बि) स्केल युनिट ०.५५१μm (C) खः । ग्यास १-जीएफपी असतत ईआर क्षेत्र वा क्लस्टरय् खने दु धाःसा मिड२-आईआरएफपी ईआर मेम्ब्रेन (सी)य् लुइकाः वितरण जुल। (डी) ग्राफं ग्यास १-जीएफपी क्लस्टरय् ग्यास १-जीएफपी व मिड २-आईआरएफपीया सापेक्षिक प्रतिदीप्ति तीव्रता ह्याउँगु बाण रेखा (बाँया) नापं क्यनातःगु दु। एयू, स्वेच्छाचारी इकाइ । (इ व एफ) सामान व ईआरइएस चिंयात स्वानाः थ्रीडी इमेजयात प्रतिनिधित्व याइ । विशिष्ट इआरइएसया लिक्क ग्यास १-जिएफपि क्लस्टर खनेदत । स्केल युनिट ०.५५१μm खः । (एफ) तुयुगु ठोस बाणं ईआरइएसलिसे स्वापू दुगु ग्यास १-जिएफपि क्लस्टरयात चिं तइ । दथुइ व जवय् च्वंगु प्यानलय् मर्ज यानातःगु तःधंगु ३डी इमेज व ल्ययातःगु ग्यास १-जीएफपी क्लस्टरया रोटेटेड भ्यू क्यनातःगु दु ।
ग्यास १-जीएफपी क्लस्टर व छगू विशिष्ट ईआरईएस दथुइ घनिष्ठ स्थानिक स्वापू ग्यास १-जीएफपी चयनात्मक ईआरईएसय् दुहां वनेफुगु संकेत बी, गुगु ईआर त्वःतेत मिड२-आईआरएफपीं छ्यलिगु चयनात्मकता स्वया फरक ख। थ्व सम्भावनायात सम्बोधन यायेत जिमिसं छगू निगू सामानया निंतिं जक ईआरईएस अनुपातया परिमाणन याना (चित्र २, ए निसें सी) । जिमिसं खना कि अप्वः धया थें इआरइएस (७०%) स छगू जक ताजिया कार्गो दइ । चित्र २सीया क्वय् या किपाय् ग्यास१-जीएफपी जक (चित्र १) वा मिड२-आइआरएफपी (चित्र २) जक दुगु ईआरईएसया निगु विशिष्ट दसु क्यनातःगु दु। उकिया विपरीत, करिब २०% इआरइएसय् छगू हे थासय् ओभरल्याप जुइगु निगू कार्गो दइ । छुं ईआरईएस (१०%) निगु प्रकारया कार्गो दुगु खने दु, तर स्पष्ट रुपं फरक थासय् अलग तयातःगु दु। अतः, थ्व तथ्यांकीय विश्लेषणं ईआर निर्यात जुइधुंका जीपीआई-एपी ग्यास१-जीएफपी व ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो मिड२-आईआरएफपी थी-थी ईआरईएसय् ब्वथलातःगु खनेदु (चित्र २डी)। थ्व वर्गीकरण दक्षता न्हापाया जैव रासायनिक विश्लेषण (६) व आकारिकी निर्धारण (७) नाप तसकं मेल खनि। ईआरइएसय् दुहां वनीगु क्वारेन्टाइनय् तयातःगु कार्गोया ब्यवहार नं झीसं अवलोकन यायेफइ (चित्र २इ व संकिपा एस२) । चित्र २ई य् क्यनातःगु दु कि ग्यास१-जीएफपी (प्यानल ३) वा मिड२-आइआरएफपी (प्यानल ४)या छगू चिधंगु भाग जक छखेपाखें ईआरईएसय् दुहां वइ व छगू असतत क्षेत्रय् सीमित जुइ । चित्र २E या प्यानल ५ य् क्यनातःगु दु कि Gas1-GFP व Mid2-iRFP गबलें गबलें छगू हे ERES य् खने दु, तर थ्व थी-थी पक्षं दुहां वइ व थी-थी COPII भेसिकलया प्रतिनिधित्व यायेफुगु थी-थी क्षेत्रय् केन्द्रित जुइ। जिमिसं थ्व नं पुष्टि याना कि C26 सेरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 या अवलोकित पृथक्करण व वर्गीकरण चयनात्मक ERES कथं विशिष्ट ख छाय् धाःसा मेगु ट्रान्समेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-ट्याग प्लाज्मा मेम्ब्रेन प्रोटिन Axl2 (27 ), Mid2-iRFP नापं समान व्यवहार क्यनाच्वंगु दु। (किपा एस १ व संकिपा एस ३) न्हुगु संश्लेषित Axl2-GFP Mid2-iRFP (चित्र S1, A व B) थें न्याःगु ER झिल्लीया माध्यमं वितरण जुइ, व अप्व ERES (चित्र S1, B निसें D)य् Mid2-iRFP नापं को-लोकलाइज जुइ। चित्र १ या प्यानल १ व २ एस १ सी ईआरईएसया निगु विशिष्ट दसु क्यनातःगु दु गन निगु ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो ओभरल्याप जुइ। थुगु अवस्थाय् निगुलिं सामान नापं ईआरइएसय् दुहां वनी (चित्र एस १ ई, प्यानल ३ व मूभि एस ३) ।
ग्यालाक्टोज इन्डुसिबल सेक्रेसन, ग्यास१-जीएफपी (जीपीआई-एपी, हरियो) व मिड२-आईआरएफपी (टीएमपी, वँचुगु) व संवैधानिक ईआरईएस लेबलिङ सेक१३-एमचेरी (ईआरईएस, म्याजेन्टा) व्यक्त याइगु sec31-1 कोषयात ३७ °C य् ३० °C निसें रिलिज move य् इन्क्यूबेट यायेधुंकाः ३० °C य् तःगु खः । ब्लक, व २० मिनेट लिपा एससीएलआईएम नापं किपा । (ए निसें सी) कार्गो व ईआरईएसं चिं तःगु १० जेड-सेक्सनया प्रतिनिधि २डी प्रोजेक्सन इमेज (ए; स्केल बार, १μm) वा ३डी सेल हेमिस्फीयर इमेज (बी व सी; स्केल युनिट, ०.४५६μm)। (बी) य् च्वंगु क्वय् या प्यानल व (सी) य् च्वंगु प्यानलय् ईआरईएस (मजेन्टा) [ग्यास १-जीएफपी (ग्रे) व मिड२-आईआरएफपी (लाइट ब्लू)]य् दुगु सामान जक क्यनेत प्रोसेस यानातःगु किपा क्यनातःगु दु । (सि) चाःगु बाण : इआरइएसं छकू जक सामान यंकी (१ निसें ४) । भुयू बाण : इआरइएसय् बिस्कं कार्गो (५) दइ । तुयुगु ठोस बाण : सह-स्थित कार्गो दुगु इआरइएस । क्वय् : ल्ययातःगु छगू हे ईआरइएसय् ग्यास १-जिएफपि (१) बाय् मिड२-आइआरएफपि (२) जक दइ । स्केल बार, १०० एनएम। (डि) (सि) स वर्णन यानातःगु फोटोमाइक्रोग्राफया मात्रा निर्धारण । छगू जक कार्गो (ग्यास १-जीएफपी वा मिड२-आईआरएफपी), अलग कार्गो व ओभरल्यापिङ कार्गो दुगु ईआरईएसया औसत प्रतिशत। स्वंगु स्वतन्त्र प्रयोगय्, ५४ कोषय् n=४३२। इरर बार = एसडी। निगू पुच्छर दुगु ज्वः मदुगु टि टेस्ट । *** पि = ०.००२ (इ) (सि) नापं चिं तयातःगु क्वारेन्टाइनय् तयातःगु कार्गोया ल्ययातःगु ईआरइएसया ३डि किपा । ग्यास १-जीएफपी (हरिभरा) (३) वा मिड२-आईआरएफपी (नीला) (४) छखें ईआरईएस (मजेन्टा)य् दुहां वइ व ईआरईएस दुनेया छगू चिधंगु थासय् सीमित जुइ। गबलें गबलें निगुलिं कथंया कार्गो छगू हे पक्षं छगू हे ईआरईएस (५) य् दुहां वइ व ईआरईएस दुनेया छगू अलग्ग थासय् सीमित जुइ । स्केल बार, १०० एनएम।
थ्व धुंका, जिमिसं छगू परिकल्पनाया परीक्षण याना कि ईआर झिल्लीइ दूगु लाङ एसिल चेन सेरामाइड (सी२६)ं ग्यास १ या विशिष्ट क्लस्टरिङ व सर्टिङयात चयनात्मक ईआरईएसय् न्ह्याकी। थुकिया निंतिं जिमिसं छगू परिमार्जित खमीर प्रजाति GhLag1 छ्यला, गुकिलि निगु इन्दोजेनस सेरामाइड सिन्थेज Lag1 व Lac1या थासय् GhLag1 (कपासया Lag1 होमोलोग) तया, गुकिया लिच्वः कथं वाइल्ड टाइप स्वया चिधंगु कोष झिल्ली सेरामाइड प्रजाति दूगु खमीर प्रजाति दयावल (चित्र ३A) (२८)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषणं क्यंगु दु कि वाइल्ड-टाइप स्ट्रेनय् कुल सेरामाइडया ९५% तसकं ताःहाकःगु (C26) चेन सेरामाइड जुइ धाःसा GhLag1 य् ८५% सेरामाइड तसकं ताःहाकःगु (C18 व C16) जुइ। ), सेरामाइडया २% जक्क तसकं ताःहाकःगु (C26) चेन सेरामाइड ख। आःतक्क GhLag1 मेम्ब्रेनय् लुयावःगु मू सेरामाइड C18 व C16 सेरामाइड जूसां एमएस विश्लेषणं नं GhLag1 स्ट्रेनय् अभिव्यक्त Gas1-GFP या GPI एन्करय् C26 सेरामाइड दूगु पुष्टि याःगु दु, गुकियात वाइल्ड टाइप लिपिडनाप तुलना यायेछिं। गुणस्तर व हे खः (किपा ३ ए) (२६) । अतः, थुकिया अर्थ खः, सेरामाइड रिमोडेलिङ एन्जाइम Cwh43 C26 सेरामाइडया निंतिं तसकं चयनात्मक जुइ, चित्र २६ य् क्यनातःगु कथं, थुकिलि GhLag1 स्ट्रेनय् म्हो मात्राय् C26 सेरामाइडं GPI एंकरयात प्राथमिकता बियाः दुथ्याकी । एस२ (२९) अथे जुसां GhLag1या सेल मेम्ब्रेनय् मूलतः C18-C16 सेरामाइड जक्क दइ धाःसा Gas1-GFP य् अझ नं C26 सेरामाइड दइ। थ्व तथ्यं थ्व तनावयात ईआरय् मेम्ब्रेन सेरामाइडया एसिल चेन लम्बाईया समस्यायात विशेष रुपं समाधान यायेत छगू आदर्श उपकरण दयेकी। वर्ग व ल्यज्याया काल्पनिक भूमिका । अनंलि, जिमिसं दकलय् न्हापां पारम्परिक फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपीया माध्यमं sec31-1 या तापक्रम संवेदनशील म्युटेन्ट एलील नापं GhLag1 य् क्लस्टरय् मुंकेगु C26 Gas1-GFP या क्षमताया अध्ययन याना, गन ईआर झिल्ली सेरामाइडय् ताःहाकःगु (C18-C16) चेन जक दयाच्वनि (चित्र ३)। जिमिसं अवलोकन याना कि sec31-1 य् अधिकांश Gas1-GFP क्लस्टरय् केन्द्रित जुल, जबकि sec31-1 GhLag1 य् Gas1-GFP ताःहाकःगु (C18-C16) ताःहाकःगु सेरामाइड ईआर झिल्लीलिसे मुख्यतः क्लस्टर मजूगु व In entire ER मेम्ब्रेनय् वितरण जूगु खः । सटीक जुइत, छाय् धाःसा सी २६ सेरामाइड-आधारित क्लस्टरिङ विशिष्ट ईआरईएस (चित्र १) नाप तसकं स्वापू दु, जिमिसं लिपा थ्व प्रक्रियाय् ईआर निर्यात प्रोटिन संयन्त्रया ज्या नं दुथ्यायेफु कि मफु धकाः अनुसन्धान याना। जीपीआई-एपीं ईआर निर्यातया निंतिं विशेष सीओपीआईआई प्रणाली छ्येलि, गुकियात जीपीआई लंगरया ग्लाइकन भागया टेड१′या संरचनात्मक रिमोडेलिङं सक्रिय रुपं नियमन याइ (३०, ३१)। अनंलि रिकम्बिनेन्त जीपीआई-ग्लाइकनयात ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्तर पी२४ कम्प्लेक्सं म्हसीकिगु या, गुकिलिं लिपा एलएसटी१यात चयनात्मक रुपं भर्ना याइ, गुगु मू सीओपीआई कार्गो बाइन्दिङ सबयुनिट सेक२४या छगू विशिष्ट आइसोफर्म ख, गुकिलिं जीपीआई-एपी-समृद्ध सीओपीआई भेसिकल्स आवश्यक जुइ (३३)। अथे जुया जिमिसं छगू डबल म्युटेन्ट दयेका गुकिलिं थ्व एकल प्रोटिन (p24 कम्प्लेक्स कम्पोनेन्ट Emp24, GPI-glycan रिमोडेलिङ एन्जाइम Ted1 व विशिष्ट COPII सबयुनिट Lst1)या डिलिसनयात sec31-1 म्युटेन्ट स्ट्रेननाप स्वाना, व इमिगु अध्ययन याना Is it possible to form GFP1-cluster)। जिमिसं अवलोकन याना कि sec31-1emp24Δ व sec31-1ted1Δ य् ग्यास १-जीएफपी मुख्यतः अनक्लस्टर जुइ व ईआर झिल्लीइ वितरण जुइ, गुगु न्हापा sec ३१-१ GhLag1 य् खनेदूगु खः, जबकि sec ३१-१lst१Δ य् ग्यास १-जीएफपी सेक ३ थें जुइ । थ्व लिच्वःतेसं ईआर मेम्ब्रेनय् सी२६ सेरामाइडया उपस्थितिया नापं ग्यास१-जीएफपीया क्लस्टरिङ नं पी२४ कम्प्लेक्सय् बाइन्द जुइमाःगु आवश्यकता दु, व विशिष्ट एलएसटी१ भर्ती यायेमाःगु आवश्यकता मदु धकाः संकेत बी। अनंलि, जिमिसं ईआर मेम्ब्रेनय् सेरामाइडया चेन लेन्थं ग्यास १-जीएफपीया पी २४ नाप बाइन्डिङयात नियन्त्रित यायेफुगु सम्भावनाया अन्वेषण याना। तर जिमिसं लुइका कि मेम्ब्रेनय् सी१८-सी१६ सेरामाइडया उपस्थितिं पी२४ कम्प्लेक्सं पुनःनिर्माण याःगु जीपीआई-ग्लाइकेन (चित्र एस३ व एस४, ए व बी) वा जीपीआई-एपीलिसे बाइन्डिङ व जीपीआई-एपी निर्यात याइगु जीपीआई-ग्लाइकेनयात छुं लिच्वः मलाकी । छ्यमता। सिओपिआइआइ उपप्रकार एलएसटि १ (किपा एस ४ सि) भर्ना या । अतः, सी२६ सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिङय् थी-थी ईआर निर्यात प्रोटिन संयन्त्रनाप प्रोटिन अन्तरक्रियाया आवश्यकता मदु, तर लिपिड लम्बाईं संचालित वैकल्पिक वर्गीकरण संयन्त्रयात समर्थन याइ। अनंलि, जिमिसं ईआर झिल्लीइ सेरामाइड एसिल चेन लम्बाइ ग्यास १-जीएफपीयात चयनात्मक ईआरईएसया रुपय् प्रभावकारी वर्गीकरणया निंतिं महत्वपूर्ण खः ला धकाः विश्लेषण याना। शर्ट-चेन सेरामाइड दूगु GhLag1 स्ट्रेनय् दूगु Gas1 ER त्वःताः प्लाज्मा मेम्ब्रेनय् दुहां वनीगु जूगुलिं (चित्र S5) जिमिसं विश्वास याना कि यदि सोर्टिङयात सेरामाइड एसिल चेनया लम्बाईं न्ह्याकल धाःसा GhLag1 स्ट्रेनय् दूगु Gas1यात रिडायरेक्ट व पार यायेफइ । व हे झिल्ली दुगु ईआरइएस सामान ।
(A) GhLag1 या सेल मेम्ब्रेनय् मू कथं चिधंगु C18-C16 सेरामाइड दइ धाःसा Gas1-GFP या GPI एन्करय् अझ नं वाइल्ड-टाइप सेलया थें हे C26 IPC दइ। माथि: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा वाइल्ड-टाइप (Wt) व GhLag1p स्ट्रेन के सेल मेम्ब्रेन में सेरामाइड का एसिल चेन लम्बाई विश्लेषण। तथ्यांकं मुक्कं सेरामाइडया प्रतिशत क्यनी । स्वंगू स्वतन्त्र प्रयोगया औसत । इरर बार = एसडी। निगू पुच्छर दुगु ज्वः मदुगु टि टेस्ट । **** पि <०.००१ तलया प्यानल : वाइल्ड-टाइप व GhLag1p स्ट्रेनय् अभिव्यक्त ग्यास १-जीएफपी (जीपीआई-आईपीसी) जीपीआई लंगरय् दूगु आईपीसीया एसिल चेन लम्बाईया एमएस विश्लेषण। डाटां मुक्कं आइपिसि सिग्नलया प्रतिशत क्यनी । न्यागू स्वतन्त्र प्रयोगया औसत । इरर बार = एसडी। निगू पुच्छर दुगु ज्वः मदुगु टि टेस्ट । एनएस, महत्वपूर्ण मखु । पि = ०.९१३४ (ख) ग्यालेक्टोज-प्रेरित ग्यास १-जीएफपी व्यक्त याइगु sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, सेक31-1ted1Δ व sec31-1lst1Δ कोषया फ्लोरोसेन्स माइक्रोग्राफयात ३७ °C य् डाउन पासस्कोरे व मिनेटपी ३ या निंतिं इन्क्यूबेट याःगु खः । २४° सेल्सियस लिपा । तुयुगु बाण : ईआर ग्यास १-जिएफपि क्लस्टर । खुल्ला बाण : अनक्लस्टर ग्यास१-जीएफपी मुक्कं ईआर झिल्लीइ वितरण जुइ, गुकिलिं ईआर विशेषता आणविक रिंग स्टेनिङ क्यनि। स्केल बार, ५ μm। (सि) (बि) स वर्णन यानातःगु फोटोमाइक्रोग्राफया मात्रा निर्धारण । पंक्टेट ग्यास १-जिएफपि संरचना दुगु कोषिकाया औसत प्रतिशत । स्वंगू स्वतन्त्र प्रयोगय्, n≥३०० कोषिकात । इरर बार = एसडी। निगू पुच्छर दुगु ज्वः मदुगु टि टेस्ट । **** पि <०.००१
थ्व समस्यायात प्रत्यक्ष रुपं समाधान यायेत जिमिसं sec31-1 तापक्रम संवेदनशील म्युटेन्ट एलील (चित्र ४ व मूभि S4) नापं GhLag1 य् Gas1-GFP व Mid2-iRFP या SCLIM भिजुअलाइजेसन याना। ईआरयात ३७°Cय् तयेधुंका व लिपा २४°Cय् पिकायेधुंका न्हुगु संश्लेषित Gas1-GFPया अप्व क्लस्टर मजूगु व ईआर झिल्लीइ वितरण मजूगु खने दु, गुकियात पारम्परिक माइक्रोस्कोपं खने दु (चित्र ४, A व B )। नापं, ईआरईएसया छगू तःधंगु प्रतिशत (६७%) य् निगु प्रकारया कार्गो सह-स्थित दु (चित्र ४डी)। चित्र ४सीया प्यानल १ व २ य् ओभरल्यापिङ ग्यास१-जीएफपी व मिड२-जीएफपी दूगु ईआरईएसया निगु विशिष्ट दसु क्यनातःगु दु। नापं निगुलिं सामान छगू हे ईआरईएसय् भर्ना याःगु खः (चित्र ४ई, प्यानल ३ व मूभि एस४) । अतः, झीगु लिच्वःं ईआर झिल्लीइ दूगु सेरामाइड एसिल चेनया लम्बाइ ईआर प्रोटिन एग्रीगेसन व वर्गीकरणया छगू महत्त्वपूर्ण निर्धारक ख धका संकेत बी।
Sec31-1 GhLag1 कोषत ग्यालाक्टोज-प्रेरित स्राव, ग्यास1-GFP (GPI-AP, हरित) व Mid2-iRFP (TMP, वँचुगु) व संवैधानिक ERES-लेबल Sec13-mCherry (ERES, म्याजेन्टा) ३७°C य् इन्क्यूबेट याइ। ३० मिनेट तक न्ह्याकादिसँ, २४° सेल्सियसय् कुहां वयाः स्राव पिहां वइ, अले २० मिनेट लिपा एससीएलआईएमं इमेज यानादिसँ । (ए निसें सी) कार्गो व ईआरईएसं चिं तयातःगु १० जेड-सेक्सनया प्रतिनिधि २डी प्रोजेक्सन इमेज (ए; स्केल बार, १μm) वा ३डी सेल हेमिस्फीयर इमेज (बी व सी; स्केल युनिट, ०.४५μm)। (बी) य् च्वंगु क्वय् या प्यानल व (सी) य् च्वंगु प्यानलय् ईआरईएस (मजेन्टा) [ग्यास १-जीएफपी (ग्रे) व मिड२-आईआरएफपी (लाइट ब्लू)]य् दुगु सामान जक क्यनेत प्रोसेस यानातःगु किपा क्यनातःगु दु । (सि) तुयुगु जाःगु बाण : इआरइएस, सामान ओभरल्याप । चायेकातःगु बाण : इआरइएसय् छगू जक बस्तु दु । क्वय् या प्यानल : ल्ययातःगु इआरइएसय् (सि) चिं तयातःगु ओभरल्यापिङ्ग सामान (१ व २) दु । स्केल बार, १०० एनएम। (डि) (सि) स वर्णन यानातःगु फोटोमाइक्रोग्राफया मात्रा निर्धारण । sec31-1 व sec31-1 GhLag1 इकाइइ छगू जक्क कार्गो (Gas1-GFP वा Mid2-iRFP) दुथ्याःगु दु, व आइसोलेटेड कार्गो व ओभरल्यापिङ कार्गोया निंतिं ईआरईएसया औसत प्रतिशत दु। स्वंगु स्वतन्त्र प्रयोगय् ५४ कोषय् n = ४३२ (sec३१-१) व ४७ कोषय् n = ४३० (sec३१-१ GhLag१) खने दु। इरर बार = एसडी। निगू पुच्छर दुगु ज्वः मदुगु टि टेस्ट । *** पी = ०.००२ (सेक३१-१) व ** पी = ०.००३१ (सेक३१-१ जीएचएलएजी१)। (इ) ओभरल्यापिङ्ग कार्गो (३) नापं ल्ययातःगु ईआरइएसया ३डी छवि (सि) य् चिं तयातःगु दु । ग्यास १-जीएफपी (हरिभरा) व मिड२-आईआरएफपी (नीला) छगू हे पक्षं ईआरईएस (मजेन्टा)या लिक्क वइ व छगू हे ईआरईएस प्रतिबन्धित क्षेत्रय् च्वनी । स्केल बार, १०० एनएम।
थ्व अध्ययनं लिपिड-आधारित प्रोटिन कार्गोयात सेक्रेटरी पथय् चयनात्मक निर्यात थासय् वर्गीकृत याइगु प्रत्यक्ष इन भिभो प्रमाण प्रदान याइ, व वर्गीकरण चयनात्मकताया निंतिं एसिल चेन लम्बाइया महत्त्वयात क्यनि। एससीएलआईएम नांया छगू शक्तिशाली व अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी प्रविधि छ्यला, जिमिसं न्हूगु संश्लेषित Gas1-GFP (छगू प्रमुख प्लाज्मा मेम्ब्रेन GPI-AP छगू तसकं ताःहाकःगु एसिल चेन (C26) सेरामाइड लिपिड भाग दुगु) खमीरय् क्यना ) असतत गोप्य प्रोटिनय् क्लस्टर यानातःगु क्षेत्रत ट्रान्सम्ब्रेम ईआरईएसया माध्यमं वितरित जुयाच्वंगु दु, ईएसया माध्यमं वितरण यानातःगु दु । ईआर झिल्ली (चित्र १)। थ्वयां अप्वः, थुगु निताजिया सामान ल्ययाः बिस्कं ईआरइएसय् दुहां वनी (किपा २) । मेम्ब्रेनय् सेलुलर सेरामाइडया एसिल चेन लम्बाइ सी२६ निसें सी१८-सी१६ तक्क म्हो जुइ, ग्यास १-जीएफपी क्लस्टर डिस्क्रिट ईआर क्षेत्रय् व्यवधानित जुइ, व ग्यास १-जीएफपीयात व हे ईआरईएसया माध्यमं ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटिन नापं ईआर त्वःतेत रिरुट जुइ (चित्र ३ व चित्र ३)। ४)।
जीपीआई-एपीं ईआरं पिहां वयेत विशेष प्रोटिन संयन्त्र छ्यलिगु जूसां जिमिसं सी२६ सेरामाइड-निर्भर पृथक्करण डिफरेन्सियल प्रोटिन अन्तरक्रियाय् निर्भर मजूगु खने दु गुकिलिं ईआरईएस विशेषज्ञता जुइफु (चित्र एस४ व एस५)। बरु, जिमिगु निष्कर्षं लिपिड-आधारित प्रोटिन क्लस्टरिङ व लिपा मेमेगु कार्गोया बहिष्करणं संचालित वैकल्पिक वर्गीकरण संयन्त्रयात समर्थन याइ। झीगु अवलोकनं ग्यास १-जीएफपी क्षेत्र वा छगू विशिष्ट ईआरईएसलिसे स्वापू दूगु क्लस्टरय् ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटिन मिड२-आइआरएफपीया अभाव दु धकाः संकेत बी, गुकिं संकेत बी कि सी २६ सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टरं सम्बन्धित ईआरईएसय् इमिगु प्रवेशयात सहज याइ, अले उगु हे इलय्, विशेष ट्रान्समेम्ब्रेनयात पिने तइ TheFigERu २) । थ्व स्वया ईआर मेम्ब्रेनय् सी१८-सी१६ सेरामाइडया उपस्थितिं जीपीआई-एपीयात क्षेत्र वा क्लस्टर दयेकीमखु, उकिं इमिसं ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटिनयात व हे ईआरईएसय् पिने वा प्रतिस्थापन याइमखु (चित्र ३ व ४)। । अतः, जिमिसं प्रस्ताव याना कि सी२६ सेरामाइडं विशिष्ट ईआरईएसनाप स्वाःगु प्रोटिनया क्लस्टरिङयात सहज याना पृथक्करण व वर्गीकरणयात न्ह्याकी।
थ्व सि२६ सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिङ्गयात छगू निश्चित इआर लागाय् गथे यानाः प्राप्त यायेगु ? मेम्ब्रेन सेरामाइडया पार्श्विक रुपय् अलग जुइगु प्रवृत्तिं चीधंगु व असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड दूगु ईआर मेम्ब्रेनया अप्व अनियमित लिपिड वातावरणय् जीपीआई-एपी व सी२६ सेरामाइडं चिधंगु व तत्काल अर्डर जुइगु लिपिड दयेकेफु। गुणस्तरीय क्लस्टर (१७, १८) थ्व चिधंगु अस्थायी क्लस्टरयात p24 कम्प्लेक्सय् बाइन्दिङ यायेधुंका अझ तःधंगु, अप्व स्थिर क्लस्टरय् फ्युज यायेछिं (34)। थ्व नापं मेल खनिगु कथं जिमिसं क्यना कि C26 Gas1-GFP यात p24 कम्प्लेक्सनाप अन्तरक्रिया यानाः तःधंगु खनेदइगु क्लस्टर दयेकेमाः (चित्र ३)। p24 कम्प्लेक्स छगू हेट्रोजाइगस ओलिगोमर ख गुकियात खमीरय् प्यंगू थी-थी p24 ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटिनं दयेकिगु या (३५), गुकिलिं मल्टिभ्यालेन्त बाइन्दिङ बी, गुकिलिं चिधंगु GPI-AP क्लस्टरया क्रस-लिङ्किङ जुइफु, गुकिलिं तःधंगु स्टेबल क्लस्टर दयेकि (३४)। जीपीआई-एपीया प्रोटिन एक्टोडोमेन दथुइ अन्तरक्रियां नं इमिगु एग्रीगेसनय् योगदान बीफु, गुकिलिं स्तनधारी ध्रुवीकृत एपिथेलियल कोषय् इमिगु गोल्जी ट्रान्सपोर्टया इलय् क्यनातःगु दु (३६)। तर ईआर मेम्ब्रेनय् सी१८-सी१६ सेरामाइड दयाच्वनिबलय् पी२४ कम्प्लेक्सं ग्यास१-जीएफपीनाप स्वापू तइबलय् तःधंगु ब्यागलं ब्यागलं क्लस्टर दइमखु। अन्तर्निहित संयन्त्र ताःहाकःगु एसिल चेन सेरामाइडया विशिष्ट भौतिक व रासायनिक गुणय् निर्भर जुइफु। कृत्रिम झिल्लीया बायोफिजिकल अध्ययनं क्यंगु दु कि ताःहाकःगु (C24) व चिहाकःगु (C18-C16) निगुलिं एसिल चेन सेरामाइडं फेज सेपरेशन यायेफुसां ताःहाकःगु एसिल चेन सेरामाइड (C24) जकं फिल्मयात पुनःआकार बीत उच्च वक्रता व फिल्म बेन्डिङयात प्रवर्द्धन यायेफु। थःथवय् सन्दर्भया माध्यमं (१७, ३७, ३८) थ्व क्यनातःगु दु कि Emp24या मानव होमोलोग TMED2या ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्सं साइटोप्लाज्मिक लोबुलय् C18 सेरामाइड-आधारित स्फिन्गोमाइलिननाप चयनात्मक रुपं अन्तरक्रिया याइ (३९)। मोलेक्युलर डाइनामिक (एमडी) सिमुलेशन छ्येला जिमिसं सी १८ व सी २६ निगुलिं सेरामाइड Emp24 ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्सया साइटोप्लाज्मिक लोबुलया चाकःलिं मुनाच्वंगु खने दु, व इमिगु वरीयता समान जुइ (चित्र S6)। थ्व खँ लुमंकेबहःजू कि थुकिलिं Emp24या ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्सं मेम्ब्रेनय् लिपिडया असममित वितरण जुइफुगु संकेत बी। थ्व स्तनधारी कोषिकाय् आधारित नकतिनिया लिच्वः खः । थुज्वःगु हे एमडी सिमुलेशनं नं इथर लिपिडया उपस्थिति क्यनी (४०) । अथे जुया जिमिसं अनुमान याना कि ईआर२६या निगु लोबुलय् दूगु सी२६ सेरामाइड स्थानीय रुपं समृद्ध जुइ। लुमिनल लोबुलय् जीपीआई-एपी प्रत्यक्ष रुपं मल्टिभ्यालेन्ट पी२४ नाप स्वापू तइ व साइटोप्लाज्मिक लोबुलय् पी२४ या चाकःलिं सी२६ सेरामाइडया संचय जुइबलय् थ्व नापंया प्रोटिन एग्रीगेसनयात प्रवर्द्धन यायेफु व झिल्ली वक्रता नं उँगलय् उत्पन्न जुइ (४१), गुकिं यानाः जीपीआई-एपी उच्च क्षेत्रय् अलग जुइ, गुकियात डिस्करे ईआर झिल्लीया क्षेत्र (४२)। न्हापाया रिपोर्टं प्रस्तावित संयन्त्रयात समर्थन याःगु खः (४३, ४४) । प्लाज्मा मेम्ब्रेनय् सेरामाइड-आधारित ग्लाइकोस्फिन्गोलिपिड (जीएसएल) नाप ओलिगोलेक्टिन्स, प्याथोजेन वा एन्टिबडीया मल्टिभ्यालेन्त बाइन्दिङं तःधंगु जीएसएल एग्रीगेसनयात ट्रिगर याइ, फेज सेपरेशन अप्वयेकी व मेम्ब्रेनया विकृति व इन्टरनलाइजेसन जुइ (४४)। इवाबुची आदि (४३) थ्व लुयावल कि ताःहाकःगु (C24) तर चिहाकःगु (C16) मखुगु एसिल चेनया उपस्थितिइ जीएसएल ल्याक्टोसिलसेरामाइडय् बाध्य जूगु मल्टिभ्यालेन्ट लिगान्दं तःधंगु क्लस्टर व मेम्ब्रेन इन्भाजिनेसनया गठनयात प्रेरित याइ, व पत्रिकाय् च्याजिट्रोपय् न्युजिट्रोपं न्यूजिट्रोपं याइगु साइटोप्लाज्मिनय् लाइन-मध्यस्थता संकेत ट्रान्सडक्सन जुइ।
स्तनधारी ध्रुवीकृत एपिथेलियल कोषय् एपिकल प्लाज्मा मेम्ब्रेनया स्तरय् एन्टि-गोल्जी नेटवर्क (TGN)या एकाग्रतां GPI-APया पृथक्करण व वर्गीकरणयात नियन्त्रण याइ (१०, ४५)। थ्व एग्रीगेसन जीपीआई-एपी ओलिगोमेराइजेसनं संचालित जुइ (३६), तर थ्व झीसं खमीरय् खनेदइगु सेरामाइड चेन लम्बाईइ नं निर्भर जुइफु। स्तनधारी जीपीआई-एपीइ ईथर लिपिड-आधारित लंगर दइ, व थुकिया रासायनिक संरचना तसकं ताःहाकःगु एसिल चेन सेरामाइड स्वया तसकं फरक जुइ, तर नकतिनि जूगु छगू अध्ययनं निगु हे लिपिडया विकासवादी भौतिक व रासायनिक गुण व ज्या समान खने दु (४०)। अतः, स्तनधारी कोषय् दूगु इथर लिपिड भाग खमीरय् दूगु सी२६ सेरामाइड नापं ज्वःलायेफु, व थुकिया भूमिका झिल्लीइ दूगु लङ्ग-चेन सेरामाइडनाप स्वापू तया जीपीआई-एपी एग्रीगेसन व सर्टिङयात प्रोत्साहन बीगु ख। थ्व सम्भावनायात आः नं प्रत्यक्ष परीक्षण यायेमाःगु दुसां न्हापाया निष्कर्षं गोल्जी म्हय् ताःहाकःगु एसिल चेन सेरामाइडया ढुवानी साइटोप्लाज्मिक ट्रान्सफर प्रोटिनं याइमखु, तर खमीर थें न्याःगु जीपीआई एन्करया संश्लेषणय् निर्भर जुइ धकाः समर्थन याइ। अतः, विकासवादी रूढिवादी संयन्त्रं छगू हे ट्रान्सपोर्ट भेसिकलय् तसकं ताःहाकःगु एसिल चेन सेरामाइड व जीपीआई-एपी (१३, १६, २०, ४६, ४७)यात चयनात्मक रुपं सह-यातायात यायेत सक्षम खनेदु।
खमीर व स्तनधारी ध्रुवीकृत एपिथेलियल सेल सिस्तमय् जीपीआई-एपी एग्रीगेसन व मेमेगु प्लाज्मा मेम्ब्रेन प्रोटिनं पृथक्करण फुक्कं कोष सतहय् थ्यने न्ह्यः जुइ। पलादिनो एट अल. (४८) नं स्तनधारी ध्रुवीकृत एपिथेलियल कोषया टिजीएनय् जीपीआई-एपी क्लस्टरिङ एपिकल प्लाज्मा मेम्ब्रेनय् जीपीआई-एपीया चयनात्मक वर्गीकरणया निंतिं जक्क आवश्यक मखु, तर जीपीआई-एपीया क्लस्टरिङ संगठन व थुकिया जैविक गतिविधियात नं नियन्त्रित याइगु खनेदु। कोष सतह । खमीरय् थ्व अध्ययनं क्यंगु दु कि ईआरय् दूगु सी२६ सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टरं प्लाज्मा मेम्ब्रेनय् जीपीआई-एपीया क्लस्टर संगठन व क्रियाशील गतिविधियात नियन्त्रित यायेफु (२४, ४९)। थ्व मोडेल नापं मेल खनिगु, GhLag1 कोषय् GPI इन्हिबितर वा कोष पःखाःया अखण्डतायात प्रभावित याइगु वासः (२८) स्वया एलर्जी जुइ, व खमीर कोषया संभोगय् प्रक्षेपित टिप सेरामाइडया फंक्शनल Gas1-GFP क्लस्टर (४९)या आवश्यकतां G संकेत याइ hLa कोषया सम्भावित शारीरिक लिच्वः। जिपिआइ-एपि इरर । तर कोष सतहया क्रियाशील संगठनयात लिपिड लम्बाईया आधारय् छनोट विधिं ईआरं प्रोग्राम यानातःगु दु कि मदु धइगु थप परीक्षण झीगु भविष्यया अनुसन्धानया विषय जुइ ।
थुगु ज्याय् छ्यःगु सैक्रोमाइसेस सेरेभिसिया प्रजाति तालिका एस १ य् न्ह्यथनातःगु दु । लाइभ सेल इमेजिङया निंतिं एससीएलआईएमया एमएमवाई१५८३ व एमएमवाई१६३५ स्ट्रेन डब्लु३०३या पृष्ठभूमिइ दयेकूगु खः । फ्लोरोसेन्ट प्रोटिन ट्याग नापं Sec13-mCherry एक्सप्रेस याइगु थ्व स्ट्रेनयात पोलिमरेज चेन रिएक्सन (PCR)-आधारित विधि छ्यला pFA6a प्लाज्मिडयात टेम्प्लेटया रुपय् दयेकूगु ख (२३)। GAL1 प्रोमोटरया नियन्त्रणय् फ्लोरोसेन्ट प्रोटिन लेबल यानातःगु Mid2-iRFP एक्सप्रेस याइगु स्ट्रेन थुकथं दयेकूगु खः । pKTiRFP-KAN वेक्टरपाखें iRFP-KanMx अनुक्रमया पीसीआर प्रवर्धन (ई. ओ'शीया उपहार, एडजेन प्लाज्मिड ल्याः ६४६८७; http://n2t.net/addgene: ६४६८७; अनुसन्धान स्रोत पहिचानकर्ता (आरआरआईडी): एडजेन_६४६८७ of C2 Mid2-iRFP जीनोम सिक्वन्सयात एम्प्लिफाइ यानाः GAL1 प्रोमोटरय् क्लोन यायेधुंका थ्व एकीकरण प्लाज्मिड pRS306या Not I-Sac I साइटय् एकीकृत जुल। लिच्वःया प्लाज्मिड pRGS7 यात Pst I नापं रेखीयकरण यानाः URA3 लोकसय् एकीकृत याःगु खः ।
ग्यास१-जीएफपी फ्युजन जीन सेन्ट्रोमियर (सीईएन) प्लाज्मिडय् जीएएल१ प्रोमोटरया नियन्त्रणय् अभिव्यक्त जुइ, गुकियात थुकथं दयेकिगु या। ग्यास १-जीएफपी अनुक्रमयात pRS416-GAS1-GFP प्लाज्मिड (२४) (एल. पोपोलोया उपहार) निसें पीसीआरं एम्प्लिफाइ यानाः सीईएन प्लाज्मिड pBEVY-GL LEU2 (सीया उपहार) या Xma I–Xho I साइटय् क्लोन यानातःगु खः । मिलर, ४. एडजेन प्लाज्मिड ल्याः ५१२२५; http://एन२टी.नेट/एडजेन: ५१२२५; आरआरआईडी: एडजेन_५१२२५)। लिच्वःया प्लाज्मिडयात pRGS6 नां तल । Axl2-GFP फ्युजन जीन नं pBEVY-GL LEU2 भेक्टोरया GAL1 प्रोमोटरया नियन्त्रणय् अभिव्यक्त जुइ, व थुकिया निर्माण थुकथं दु। एक्सएल२-जीएफपी अनुक्रमयात पीआरएस३०४-पी२एचएसई-एक्सएल२-जीएफपी प्लाज्मिड (२३)ं पीसीआरं एम्प्लिफाइ यानातःगु ख, व पीबीईभी-जीएल एलईयू२ भेक्टोरया बाम एचआई-पीएसटी I साइटय् क्लोन यानातःगु ख। लिच्वःया प्लाज्मिडयात pRGS12 नां तल । थुगु अध्ययनय् छ्यःगु ओलिगोन्युक्लियोटाइडया अनुक्रम तालिका एस२ स न्ह्यथनातःगु दु ।
थ्व स्ट्रेनयात ०.२% एडेनिन व २% ग्लुकोज [YP-डेक्सट्रोज (YPD)], २% राफिनोज [YP-राफिनोज] समृद्ध खमीर अर्क प्रोटिन p (YP) माध्यम (१ % खमीर अर्क व २% प्रोटिन ept) नापं पूरक यानातःगु ख। (YPR)] वा 2% ग्यालाक्टोज [YP-galactose (YPG)] कार्बन स्रोतया रुपय्, वा छगू सिन्थेटिक न्यूनतम माध्यमय् (0.15% खमीर नाइट्रोजन आधार व 0.5% अमोनियम सल्फेट) पोषणया निंतिं आवश्यक उपयुक्त एमिनो एसिड व आधारया पूरक , व 2synthe% ग्यालाक्टोज माध्यम2 वा सहित) (सिन्थेटिक ग्यालाक्टोज न्यूनतम माध्यम) कार्बन स्रोतया रुपय्।
रियल-टाइम इमेजिङया निंतिं, GAL1 प्रोमोटर अन्तर्गत कन्स्ट्रक्ट एक्सप्रेस याइगु तापक्रम-संवेदनशील sec31-1 म्युटेन्ट सेलयात २४°C य् YPR माध्यमय् रात्रिभोज निसें मिड-लग चरणय् बुइकल। २४° सेल्सियसय् १ घण्टाया निंतिं वाईपीजीइ इन्डक्सन यायेधुंका कोषयात ३७° सेल्सियसय् ३० मिनेटया निंतिं एसजीइ इन्क्युबेट याइ, व लिपा २४° सेल्सियसय् स्थानान्तरण याना स्राव ब्लकं पिहां वइ। कोषिकायात ग्लास स्लाइडय् फिक्स यायेत व एससिएलआइएमं इमेज यायेत कन्कानाभालिन ए छ्यःगु खः । एससीएलआईएम ओलम्पस आईएक्स-७१ इन्भर्टेड फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोप व यूपीलानएसएपो १००×१.४ न्युमेरिकल एपर्चर आयल लेन्स (ओलिम्पस), उच्च गति व उच्च-सिग्नल-टु-नॉइज रेसियो इन्टेन्सर रोटेटिङ डिस्क कन्फोकल स्क्यानर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम इमेज सिस्टमया संयोजन खः । (हामामात्सु फोटोनिक्स) ×२६६.७या अन्तिम म्याग्निफिकेशन दूगु म्याग्निफाइङ लेन्स प्रणाली व इलेक्ट्रोनयात गुणन याइगु चार्ज-कपल्ड डिभाइस क्यामरा (हामामात्सु फोटोनिक्स) (२१) बिइफु। कस्टम सफ्टवेयर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) पाखें किपा अधिग्रहण याइ । थ्रीडी इमेजया निंतिं जिमिसं कस्टम-मेड पिजोइलेक्ट्रिक एक्युएटर छ्यला वस्तुगत लेन्सयात भर्टिकल रुपं कम्पन याना, व अप्टिकल पार्टयात १०० एनएमया दूरीइ छगू स्ट्याकय् मुंका। जेड-स्ट्याक इमेजयात थ्रीडी भोक्सेल डाटाय् हिलेगु याइ, व रोटेटिङ डिस्क कन्फोकल माइक्रोस्कोपया निंतिं छ्येलिगु सैद्धान्तिक प्वाइन्ट स्प्रेड फङ्क्सनयात भोलोसिटी सफ्टवेयर (पर्किनएल्मर)ं डिकन्भोलुसन प्रोसेसिङ्गया निंतिं छ्येलिगु या। सह-स्थान विश्लेषणया निंतिं स्वतः थ्रेसहोल्ड यायेत भोलोसिटी सफ्टवेयर छ्यला कार्गो सहितया ईआरईएस मापन याःगु खः । मेटामर्फ सफ्टवेयर (मोलेक्युलर डिभाइस) छ्यलाः लाइन स्क्यान विश्लेषण याःगु खः ।
तथ्यांकीय महत्व निर्धारण यायेत ग्राफप्याड प्रिज्म सफ्टवेयर छ्य । निगु पुच्छरया स्टुडेन्टया टि-टेस्ट व साधारण एकतर्फी विश्लेषणया भेरिएन्स (एनोभा) परीक्षणया निंतिं पुचः दथुइ अन्तरं P <0.05 (*) य् उल्लेखनीय प्रभाव लाकीगु कथं कायेगु या।
ग्यास १-जीएफपीया फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपीया निंतिं लग फेज कोषयात वाईपीडीइ चान्हय् बुइकाः सेन्ट्रिफ्युगेसनं मुंकाः फस्फेट बफर सेलाइनं निक्व धुनाः कम्ती नं १५ मिनेट च्वापुइ इन्क्युबेट यानाः न्हापा वर्णन यानातःकथं माइक्रोस्कोपया अन्तर्गत न्ह्यःने यंकल (चेक२४)। अधिग्रहणया निंतिं वस्तुगत लेन्स, एल ५ (जीएफपी) फिल्टर, हामामात्सु क्यामरा व एप्लिकेशन सुइट एक्स (एलएएस एक्स) सफ्टवेयर दुगु लाइका डीएमआई८ माइक्रोस्कोप (एचसीएक्स पीएल एपीओ १००३/१.४० आयल पीएच३ सीएस) छ्यःगु खः । ।
नमूनायात १० मिनेटया निंतिं ६५°Cय् एसडीएस नमूना बफरं विकृत यानातःगु ख, व लिपा एसडीएस-पोलियाक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (PAGE)या माध्यमं अलग यानातःगु ख। इम्युनोब्लोटिङ्ग विश्लेषणया निंतिं, छगू ​​लेनय् १० μl नमूना लोड याःगु खः । प्राथमिक एन्टिबडी : १:३००० या पातलापनय् खरगोशया पोलिक्लोनल एन्टि-ग्यास १, १:५०० या पातलापनय् खरगोशया पोलिक्लोनल एन्टि-Emp24 व १:३००० या पातलापनय् खरगोशया पोलिक्लोनल एन्टि-जीएफपी (एच. रिजम्यानया उपहार) छ्येलादिसँ। माउस मोनोक्लोनल एन्टि-पीजीके१ एन्टिबडी १:५००० (जे डे ला क्रुजया उपहार)या पातलापनय् छ्यःगु ख। सेकेन्डरी एन्टिबडी : हर्सरेडिश पेरोक्सिडेज (एचआरपी) कन्जुगेटेड गोट एन्टि-रेबिट इम्युनोग्लोबुलिन जी (आइजीजी) १:३००० (पियर्स)या पातलापनय् छ्यलिगु या। एचआरपि-कन्जुगेटेड गोट एन्टि-माउस आइजिजि १:३००० (पियर्स)या पातलापनय् छ्यःगु खः । सुपरसिग्नल वेस्ट पिको रिएजेन्ट (थर्मो फिशर साइन्टिफिक)या केमिलुमिनेसेन्स विधिं इम्युन रेस्पोन्स जोनया अवलोकन याःगु खः ।
(३१) य् वर्णन यानातःगु कथं समृद्ध ईआर अंशय् प्राकृतिक इम्युनोप्रेसिपिटेशन प्रयोग याःगु खः । संक्षेपय्, टिएनई बफर [५० एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच ७.५), १५० एमएम एनएसीएल, ५ एमएम ईडीटीए, १ एमएम फिनाइलमेथाइलसल्फोनिल फ्लोराइड व प्रोटिज इन्हिबितर मिश्रण) ६०० एनएम ( ओडी६००) य् १०० ट्विसय् डिइस्टिकलय् खमीर कोषयात हिलेगु या। थुकियात ग्लासया मणिं त्वाःथलाबिल, अले कोषया मलमूत्र व ग्लासया मणियात सेन्ट्रिफ्युगेसन यानाः लिकयाबिल । अनंलि सुपरनेतेन्तयात १७,००० ग्रामय् १५ मिनेटया निंतिं ४° सेल्सियसय् सेन्ट्रिफ्युज यानातःगु ख। थ्व पेलेटयात टिएनइइ हाकनं सस्पेन्ड याना डिजिटलिस सापोनिन १%या अन्तिम एकाग्रताय् तनाबिल। थ्व सस्पेन्सनयात ४°Cय् रोटेशन याना १ घण्टा तक्क इन्क्युबेट यानातःगु ख, व अनंलि ४°Cय् १३,००० g य् ६० मिनेट तक्क सेन्ट्रिफ्युगेसन याना अघुलनशील घटकत लिकाःगु ख। ग्यास१-जीएफपी इम्युनोप्रेसिपितेसनया निंतिं दकलय् न्हापां नमूनायात ४°Cय् १ घण्टाया निंतिं खाली एगारोस बिड्स (क्रोमोटेक) नापं प्रि-इन्क्युबेट यायेमाः, व लिपा ४°Cय् ३ घण्टाया निंतिं GFP-Trap_A (क्रोमोटेक) नापं इन्क्युबेट यायेमाः। इम्युनोप्रेसिपिटेटेड बिडयात ०.२% डाइगोक्सिजेनिन दूगु टिएनइं प्यकः धुनाः एसडीएस नमूना बफरं एलुतेसन यानाः एसडीएस-पेजय् अलग यानाः इम्युनोब्लोटिङं विश्लेषण याःगु खः ।
(३१) य् वर्णन यानातःकथं, समृद्ध ईआर अंशय् क्रस-लिङ्किङ निर्धारण याःगु खः । संक्षेपय्, समृद्ध ईआर अंशयात ०.५ एमएम डाइथियोबिस (सुक्सिनिमिडाइल प्रोपिओनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर साइन्टिफिक, रकफोर्ड, आईएल, अमेरिका; २०°से, २० मिनेट) नाप इन्क्यूबेट यानातःगु ख। क्रसलिङ्किङ रिएक्सनयात ग्लाइसिन (५० एमएम अन्तिम एकाग्रता, ५ मिनेट, २०°C) तया क्वचायेकल।
न्हापा वर्णन यानातःकथं (५०) वाइल्ड-टाइप व GhLag1 स्ट्रेनय् सेरामाइडया एमएस विश्लेषण याःगु खः । संक्षेपय्, कोषयात ३०° सेल्सियसय् वाईपीडीइ एक्सपोनेन्सियल फेज (३ निसें ४ ओडी६०० युनिट/एमएल)य् बुइकल, व २५×१०७ कोषयात कायेगु याइ। इमिगु मेटाबोलिज्म ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिडं स्याइ । निष्कर्षण विलायक [इथेनॉल, लः, ईथर, पाइरिडिन व ४.२ एन एमोनियम हाइड्रोक्साइड (१५:१५:५:१:०.०१८ v/v)] व १.२ एनएमओएल आन्तरिक मानक सी १७ सेरामाइड (८६०५१७, अवन्ती पोलार लिपिड) गुणस्तरया छ्येला। अर्कया हल्का क्षारीय हाइड्रोलाइसिस यायेत मोनोमेथिलामिन रिएजेन्त [मेथनोल, लः, एन-ब्युटानोल व मिथाइलामिन द्रावण (४:३:१:५ v/v)] छ्येला, व लिपा लः-संतृप्त एन-ब्युटानोल छ्येला डिसाल्ट यायेगु या। अन्तय् थ्व अर्कयात पोजिटिभ मोड सोल्भेन्ट [क्लोरोफर्म/मेथनोल/लः (२:७:१) + ५ एमएम एमोनियम एसिटेट]य् पुनःसस्पेन्ड याना मास स्पेक्ट्रोमिटरय् इन्जेक्सन यात। स्फिन्गोलिपिड अणुया म्हसीका व परिमाणनया निंतिं मल्टि-रिएक्सन मोनिटरिंग (एमआरएम) याःगु खः । टिएसक्यू भ्यान्टेज टर्सरी क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक)य् लिपिड विश्लेषणया निंतिं रोबोटिक नैनोफ्लो आयन स्रोत नैनोमेट एचडी (एडभियन बायोसाइन्सेस, इथाका, एनवाई) तयातःगु दु । टक्कर उर्जा प्रत्येक सेरामाइड वर्गया निंतिं अनुकूलित जुइ । एमएस डाटा पोजिटिभ मोडय् दत । प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिया निंतिं, लिपिड संकेत स्वंगु स्वतन्त्र मापनया मध्यमान ख।
(३१) य् वर्णन यानातःगु कथं ग्यास १-जीएफपी व्यक्त याइगु कोष (८००×१०७)यात प्राकृतिक इम्युनोप्रेसिपिटेशनया अधीनय् तःगु ख। शुद्धिकरण जूगु ग्यास १-जीएफपीयात एसडीएस-पेजं अलग यानाः पोलिभिनाइलाइडिन फ्लोराइड (पीभीडीएफ) मेम्ब्रेनय् स्थानान्तरण याःगु खः । पिभिडिएफयात एमाइड ब्लाकं दाग तयाः प्रोटिनयात कल्पना याःगु खः । ग्यास १-जीएफपी ब्याण्डयात पीभीडीएफं चीकाः ५ क्वः मेथनोलं व छक्वः लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-एमएस (एलसी-एमएस) ग्रेडया लः तयाः सिलाबिल । मेम्ब्रेन स्ट्रिपयात ५००μl ०.३ एम इनोएसि (pH ४.०), बफर व ५००μl ताजा घोलित १ एम सोडियम नाइट्राइट मिश्रण ३७°C य् ३ घण्टा तक्क इन्क्यूबेट याना लिपिड फ्राक्सन ग्यास १-जीएफपी व इनोकोसाइल दथुइ लिपिड रिलिज जुइ। (५१) व धुंका मेम्ब्रेन स्ट्रिपयात एलसी-एमएस ग्रेडया लः तयाः प्यकः सिलाः कोथाया तापक्रमय् सुका -८०° सेल्सियसय् नाइट्रोजन वायुमण्डलय् विश्लेषण मजुतले भण्डारण यानातःगु खः । नियन्त्रणया रुपय्, प्रत्येक प्रयोगया निंतिं पिभिडिएफ झिल्लीया प्वंगु नमूना छ्यःगु खः । ग्यास १-जीएफपीं पिकाःगु लिपिडयात एमएसं वर्णन यानातःकथं विश्लेषण यात (५०)। संक्षेपय्, जीपीआई-लिपिड दूगु पीभीडीएफ स्ट्रिपयात ७५μl नेगेटिभ मोल्ड सोल्भेन्ट [क्लोरोफर्म/मेथनोल (१:२) + ५ एमएम एमोनियम एसिटेट]य् पुनःसस्पेन्ड यानाः इलेक्ट्रोस्प्रे आयनाइजेसन (ईएसआई)-एमआरएम/एमएस स्फिन्गोलिपिड प्रजातिया विश्लेषण (टीएसक्यू भ्यान्टेज) पास याःगु खः । थुगु अवस्थाय्, एमएस डाटा नेगेटिभ आयन मोडय् दत ।
न्हापा न्ह्यथनातःकथं, जीपीआई लंगरया लिपिड भाग [३एच]-इनोसिटोल-लेबल यानातःगु जीपीआई-एपी (१६) स्वया अलग यानातःगु ख। लिपिडयात सोल्भेन्ट सिस्टम (५५:४५:१० क्लोरोफर्म-मेथनोल-०.२५% केसीएल) छ्येला थिन-लेयर क्रोमेटोग्राफीं अलग याना एफएलए-७००० (फुजिफिल्म) छ्येला भिजुअलाइज यानातःगु ख।
Gas1-GFP (600×107) एक्सप्रेस याइगु कोषयात TNE बफर नापं TNE बफरं निक्व: धुना, व ग्लास बिडं त्वाःथला, व लिपा कोषया मलमूत्र व ग्लास बिड लिकायेत सेन्ट्रिफ्युज याना। अनंलि सुपरनेतेन्तयात १७,००० ग्रामय् १ घण्टा ४° सेल्सियसय् सेन्ट्रिफ्युज यानातःगु ख। थ्व पेलेटयात टिएनइइ धुनाः ०.२% डिजिटलिस सापोनिन दूगु टिएनइइ १ यू पीआई-पीएलसी (इन्भिट्रोजेन) तयाः ३७° सेल्सियसय् १ घौतक इन्क्यूबेट यानातःगु खः । एन्जाइम उपचार धुंका १७,००० ग्रामय् ४° सेल्सियसय् १ घण्टाया निंतिं सेन्ट्रिफ्युगेसन याना झिल्ली लिकया यंकल। ग्यास १-जीएफपीयात इम्युनोप्रेसिपिटेट यायेत सुपरनेतेन्तयात जीएफपी-ट्र्याप_ए (क्रोमोटेक) नापं ४°Cय् चान्हय् इन्क्युबेट यानातःगु ख। एसडीएस-पेजं अलग यानातःगु शुद्धिकरण यानातःगु ग्यास १-जीएफपीयात कूमासी ब्रिलियन्ट ब्लुं दाग तःगु खः । ग्यास १-जीएफपी स्टेनिङ ब्याण्डयात एक्वेडक्टया घेराय् च्वंगु ग्रें चीकाः आयोडोएसिटामाइडं एल्काइलेशन व डाइथियोथ्रेइटोलं रिडक्सन यायेधुंका ट्रिप्सिन नापं इन-जेल पाचन याःगु ख। जिपिआइ-ग्लाइकेन्स नापं ट्रिप्टिक पेप्टाइड व पेप्टाइड लिका अले गंकि । गंगु पेप्टाइडयात २० माइक्रोलिटर लःया दुने ल्वाकछ्यानाबिल । एलसिइ छगू ब्व (८μl) इन्जेक्सन या । विशिष्ट ढाल अवस्थाय् पेप्टाइड अलग यायेत अक्टाडेसिलसिलेन (ओडीएस) स्तम्भ (डेभोसिल ३००ओडीएस-एचजी-५; दुनेया व्यास १५० मिमी×१.० मिमी; नोमुरा केमिकल, आइची प्रान्त, जापान) छ्यःगु ख। मोबाइल चरण विलायक ए (०.०८% फर्मिक एसिड) व विलायक बी (८०% एसिटोनाइट्रिलय् ०.१५% फर्मिक एसिड) ख। एक्सेला एचपीएलसी सिस्टम (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, बोस्टन, म्यासाचुसेट्स) छ्यला ५५ मिनेटया दुने ५० μl min-१ या प्रवाह दरय् स्तम्भयात ५ मिनेटया दुने विलायक ए नापं एलुतेट याःगु ख, व अनंलि विलायक बीया एकाग्रता ४०% तक्क अप्वयेकूगु ख। , संयुक्त राज्य अमेरिका). थ्व एलुएटयात ईएसआई आयन स्रोतय् निरन्तर रुपं दुथ्याकल, व ट्रिप्टिक पेप्टाइड व जीपीआई-ग्लाइकन दूगु पेप्टाइडयात एलटीक्यू अर्बिट्र्याप एक्सएल (हाइब्रिड लिनियर आयन ट्र्याप-अर्बिट्र्याप मास स्पेक्ट्रोमिटर; थर्मो फिशर साइन्टिफिक)ं विश्लेषण यात। एमएस सेटअपय् क्यापिलारी स्रोतया भोल्टेज ४.५ केभी तःगु ख, व ट्रान्सफर क्यापिलारीया तापक्रम ३००° सेल्सियसय् तःगु ख। क्यापिलारी भोल्टेज व ट्यूब लेन्स भोल्टेज क्रमशः १५ भि व ५० भिइ सेट याःगु खः । एमएस डाटा ३००/m/z मास/चार्ज रेसियो (m/z) ३००० या मास रेन्जय् पोजिटिभ आयन मोडय् (६०,००० या रिजोलुसन; मास एक्युरेसी १० भाग प्रति मिलियन) प्राप्त जूगु खः । टक्कर प्रेरित विघटन (सीआईडी)]।
एमडी सिमुलेशन ग्रोमाक्स (५२) सफ्टवेयर व मार्टिनी २ फोर्स फिल्ड (५३-५५) छ्यला याःगु ख। अनंलि CHARMM GUI मेम्ब्रेन बिल्डर (५६, ५७) छ्यला डायोलियोलफोस्फेटिडाइलकोलिन (DOPC) व Cer C18 वा DOPC व Cer C26 दूगु बाइलेयर दयेकल। Cer C26 या टोपोलोजी व कोअर्डिनेट स्फिन्गोसिन टेलया अतिरिक्त मणित लिकया DXCE पाखें प्राप्त जुइ। क्वय् वर्णन यानातःगु प्रक्रिया छ्यला डबल लेयरयात सन्तुलन यानाः चले यायेगु, अनंलि सिस्टमया लिपांगु कोअर्डिनेट छ्यला Emp24 दुगु सिस्टम दयेकेगु । खमीर Emp24 (अवशेष १७३ निसें १९३)या ट्रान्समेम्ब्रेन डोमेनयात भिजुअल एमडी (VMD) टूल मोलेक्युलर स्ट्रक्चर (५८) छ्यला α-हेलिक्सया रुपय् दयेकूगु ख। अनंलि ओभरल्यापिङ लिपिड लिकायेधुंका प्रोटिनयात तःग्वःगु दानेदार याना CHARMM GUI छ्यला बाइलेयरय् दुथ्याकल। अन्तिम प्रणालीइ १२०२ डीओपीसी व ३०२ सेर सी२६ वा ११९७ डीओपीसी व २९५ सेर सी१८ व ईएमपी२४ दु। सिस्टमयात ०.१५० एम एकाग्रताय् आयनाइज या । निगू बाइलर कम्पोजिसनया निंतिं प्यंगू स्वतन्त्र प्रतिलिपि दयेकूगु खः ।
लिपिड बाइलेयरयात CHARMM GUI प्रक्रिया छ्येला सन्तुलित याइ, गुकिलि ४,०५,००० स्टेपयात न्यूनतम यायेगु व अनंलि सन्तुलन यायेगु याइ, गन स्थितिया बाधात बुलुहुँ म्हो जुइ व मदइ, व ईया स्टेप ०.००५ ps निसें ०.०२ ps तक्क अप्वयेकिगु या। इक्विलिब्रेशन धुंका, थुकिं ०.०२ पिएसया ई स्टेप नापं ६ माइक्रोएस उत्पादन याइ। Emp24 तयेधुंकाः व हे CHARMM GUI प्रक्रिया छ्यला सिस्टमयात न्यूनतम व सन्तुलन यायेगु, अले उत्पादनय् ८ s तक चले यायेगु ।
सकल प्रणालीया निंतिं सन्तुलन प्रक्रियाया इलय् दबावयात बेरेन्दसेन बारोस्ट्याटं (५९) नियन्त्रण याइ, व उत्पादन प्रक्रियाया इलय् दबावयात पारिनेलो-रहमान बारोस्ट्यातं (६०) नियन्त्रण याइ। दक्वं अवस्थाय्, औसत दाब १ बार जुइ व सेमि-आइसोट्रोपिक दाब युग्मन योजना छ्यली । सन्तुलन व उत्पादन प्रक्रियाय् क्रमशः प्रोटिन, लिपिड व विलायक कणया तापक्रमयात जोडे यायेत स्पीड रिक्यालिब्रेशन दूगु थर्मोस्टेट (६१) छ्येलिगु या। दक्वं अपरेशनया झ्वलय्, लक्ष्य तापक्रम ३१०के खः । ०.००५ बफर टॉलरेन्स दूगु भर्लेट योजना छ्येला पेयरिङ लिस्ट दयेका नन-बन्डिङ अन्तरक्रियाया गणना याइ। प्रतिक्रिया क्षेत्र व १.१ एनएमया कट-अफ दूरी छ्यला कुलम्ब पदया गणना याइ। भ्यान्दर वाल्स खँग्वःय् १.१ एनएमया कट-अफ दूरी दूगु कट-अफ योजना छ्येलिगु या, व भर्लेट कट-अफ योजना सम्भावित ड्रिफ्टया निंतिं छ्येलिगु या (६२)।
भिएमडी छ्येला डीओपीसी फस्फेट बिड वा सेरामाइड एएम१ बिड व प्रोटिन दथुइ कटअफ वेभलेन्थ ०.७ एनएम जुइ, व प्रोटिननाप अन्तरक्रिया याइगु लिपिडया ल्याः गणना याइ। क्वय् बियातःगु सूत्र कथं (६३) य् थें डिप्लेसन-इन्रिचमेन्ट (DE) फ्याक्टरया गणना या : DE फ्याक्टर = (प्रोटिनय् कुल लिपिडया मात्रा ०.७) प्रोटिनय् ०.७ (कुल लिपिडय् Cerया मात्रा)
रिपोर्ट यानातःगु मू औसतया रुपय् प्राप्त जुइ, व त्रुटि बारत एसईया प्यंगू स्वतन्त्र प्रतिलिपि जुइ। डीई कारकया तथ्यांकीय महत्त्व टी परीक्षण [(औसतडीई-कारक-१)/एसई]पाखें गणना याइ। छगू पुच्छर वितरणं पि मानया गणना या ।
ट्रेसया लिपांगु २५० एनएस दुने Emp24 दूगु प्रणालीया २D लेटरल डेन्सिटी नक्सा गणना यायेत GROMACS उपकरण छ्यःगु खः । सेरामाइडया समृद्धि/क्षय नक्सा कायेत सेरया घनत्व नक्सायात सेर व डीओपीसीया नक्साया योगं भाग याइ, व अनंलि म्हय् सेरया एकाग्रतां भाग याइ। व हे उंया नक्सा स्केल छ्यल ।
थुगु च्वसुया निंतिं पूरक सामाग्रीया निंतिं, http://एडभान्सेस.साइन्सम्याग.ओर्ग/सिजिआइ/कन्टेन्ट/फुल/६/५०/इएबा८२३७/डिसि१ स्वयादिसँ ।
थ्व क्रिएटिभ कमन्स एट्रिब्युसन-गैर-व्यावसायिक लाइसेन्सया शर्त अन्तर्गत वितरण यानातःगु खुल्ला पहुँच च्वसु खः, गुकिं छुं नं माध्यमय् छ्यलेगु, वितरण यायेगु व पुनरुत्पादन यायेगु अनुमति बी, गुबले तक अन्तिम छ्यलाबुला व्यावसायिक लाभया निंतिं मखु व मूल कृति सही जुइगु आधार जुइ । भोंदां।
नोट : जिमिसं छितः छिगु इमेल एड्रेस बियादिसँ धकाः जक धायेगु यानाच्वना, गुकिं छिं पेजय् सिफारिस यानादीम्ह मनुखं छिं इमेल स्वयेगु इच्छा यानादीगु व स्पाम मखु धकाः सीके फइ । जिमिसं छुं नं इमेल एड्रेस काये मखु ।
छि आगन्तुक खः ला धकाः जाँच यायेत व स्वचालित स्पाम दुथ्याकेगु ज्यायात पनेगु निंतिं थुगु न्ह्यसः छ्यली ।
सोफिया रोड्रिगेज-गालार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना साबिडो-बोजो, एलेजान्ड्रो कोर्टेज · गोमेज (एलेजान्ड्रो कोर्टेस-गोमेज), आत्सुको इकेदा (आत्सुको इकेदा), भलेरिया जोनी (भलेरिया जोनी), अक्सिलियाडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज लोहोपे लोर्गिजोपे (लिनेरो), वागा), मिसाको अरमन (मिसाको अरमन), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टेफानो फेनी, अकिहिको नाकानो, म्यानुअल मुनिज
थ्रीडी उच्च-रिजोलुसन रियल-टाइम इमेजिङं चयनात्मक आउटपुट साइटय् प्रोटिन वर्गीकरणया निंतिं सेरामाइड चेन लम्बाईया महत्त्व क्यनि।
सोफिया रोड्रिगेज-गालार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना साबिडो-बोजो, एलेजान्ड्रो कोर्टेज · गोमेज (एलेजान्ड्रो कोर्टेस-गोमेज), आत्सुको इकेदा (आत्सुको इकेदा), भलेरिया जोनी (भलेरिया जोनी), अक्सिलियाडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज लोहोपे लोर्गिजोपे (लिनेरो), वागा), मिसाको अरमन (मिसाको अरमन), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टेफानो फेनी, अकिहिको नाकानो, म्यानुअल मुनिज
थ्रीडी उच्च-रिजोलुसन रियल-टाइम इमेजिङं चयनात्मक आउटपुट साइटय् प्रोटिन वर्गीकरणया निंतिं सेरामाइड चेन लम्बाईया महत्त्व क्यनि।
©२०२० अमेरिकन एसोसिएसन फर द एडभान्समेन्ट अफ साइन्स । सकतां अधिकार सुरक्षित । एएएएस हिनारि, अगोरा, ओएआरई, कोरस, क्लक्सएसएस, क्रसरेफ व काउन्टरया साझेदार खः । विज्ञान प्रगति आईएसएसएन २३७५-२५४८।